果蝇咽侧体中 P450 酶参与保幼激素合成的研究

Juvenile hormone (JH), a type of sesquiterpenoid chemicals synthesized and secreted by corpus allatum (CA), is one of the two most important hormones which are responsible for insect metamorphosis and development. For that reason, JH and its analogues have a widespread prospect in the field of pest control and beneficial insect usage. Our previous studies showed Drosophila CA produces three sesquiterpenoid products, namely JH bisepoxide (JHB3), JH III, and methyl farnesoate (MF), and demonstrated that MF play a dual role, directly functioning as a hormone itself by acting through the JH receptor Met/Gce and as a JHB3 precursor, in regulating Drosophila metamorphosis. P450 epoxidase is one of the most important enzymes in catalyzing JH biosynthesis. However, the exactly P450 involved in the pathway and the interaction model remains unclear. Based on these findings, firstly, with the method of RNAi technology, we propose to screen the P450 epoxidase(s) which are responsible for the JH biosynthesis in Drosophila CA; and then using the technique of molecular biology, biochemistry and Drosophila genetics, we intent to further confirm the function of candidate enzyme(s). This study will clarify the P450 epoxidase(s) which is(are) participate(s) in JH biosynthesis in Drosophila CA and provide a new insight and (a) new target(s) into the field of pest control and beneficial insect usage.

保幼激素是由咽侧体合成并分泌的一种倍半萜类化合物，是调控昆虫变态和发育的两种主要激素之一，因而JH及其类似物在害虫的防治和益虫的利用领域具有广泛的应用前景。申请者在前期研究中发现果蝇咽侧体中合成并分泌JHB3、JH III 和甲基法尼酯三种倍半萜类化合物，并证明了MF 在果蝇变态过程既可以作为JHB3的前体，又可以通过受体Met/Gce直接发挥激素的功能。而P450环氧化酶是催化JH合成的重要酶之一，但具体参与的P450种类和转化的途径尚不明晰。本项目拟以果蝇为基本材料，利用 RNAi 筛选出在咽侧体中可能参与JH合成的P450环氧化酶；继而运用分子生物学、生物化学，以及果蝇遗传学等方法和手段验证候选基因的功能。此研究将阐明果蝇咽侧体中参与JH合成的P450环氧化酶，为害虫防治和益虫利用提供理论依据和新的作用靶标。

昆虫JH的合成需要P450酶的催化，本项目主要利用果蝇遗传学操作方法，结合生理生化和分子方面的技术初步鉴定出了P450基因cyp6g2参与JH的合成。首先通过CRISPR/Cas9技术构建cyp6g2完全缺失突变体，检测其表型，发现该突变体部分致死，且卵巢变小，生殖力显著降低，与JH部分缺失表型类似。进而构建了cyp6g2和jhamt双突变体，发现该双突变体发育延迟、蛹期完全致死，且致死表型与JH受体Met、gce双突变体类似，JH类似物mthoprene可以成功挽救cyp6g2、jhamt双突变体发育到成虫。上述结果基本上证明了cyp6g2是参与JH合成的P450酶，为进一步明晰果蝇中JH合成的途径奠定了基础。进一步确证所需的cyp6g2突变体和超表达果蝇中JH相关的成分分析正在进行中。另外项目还研究了cyp401a1的功能，通过敲除突变和过表达等检测相关表型以及JH、20E信号通路的相关基因的表达，结果显示cyp401a1可能不参与JH或20E的合成，但推测可能与营养相关并参与卵巢中卵的排放。此外本项目还利用生化的方法，在原核生物中表达了果蝇金属蛋白酶Mmp1和Mmp2，通过亲和层析的方法，进行纯化、重折叠并进行了底物分析。在此基础上，本项目进一步利用生化、分子和细胞等方法研究了JH和20E协同调控Mmps诱导的脂肪体解离发育时间的分子机制，结果显示JH通过Kr-h1直接抑制Mmp并激活Mmp抑制子timp的表达，抑制脂肪体的解离。而20E则通过受体EcR、初级应答基因E75、Blimp-1和DHR3作用于βftz-F1的表达，然后βftz-F1直接激活Mmp并抑制timp的表达，促进脂肪体的解离。该研究进一步明晰了果蝇在变态过程中器官组织解离和重构的分子机制。项目资助发表SCI论文3篇，待发表2篇；共协助培养研究生3名。