利用双光子FLIM技术动态监测镉对紫贻贝的毒理效应过程

Cadmium (Cd) is a typical heavy metal pollutant in the intertidal zone of China. At present, the study of marine shellfish in the intertidal zone is one of the difficulties in marine biology research. Traditional biochemical analysis method can only obtain static information and cannot achieve live observations. To solve this problem, a two-photon excited fluorescence lifetime imaging (FLIM) method will be proposed in this project to dynamically monitor the toxicological processes of Cd stress in mussel Mytilus galloprovincialis. Firstly, an experimental model of Cd stress in mussel will be established, and then the gene expression profiles of miRNA and mRNA will be sequenced to obtain the biomarker in response to Cd stress. Secondly, the biomarker will be used to mark the organelles with organic fluorescent probes. The distribution of Cd, biomarker, and organelles will be obtained using Cd probes. At last, the colocalization information of Cd, biomarker, and organelles will be obtained using multi-color fluorescence microscopy. The two-photon excitation FLIM method will be used to obtain the quantitative data of microenvironment changes during Cd stress in vivo. These data will be used to analyze the toxicological effects of Cd in the mussels in vivo, cells, and molecules, with advantages of high sensitivity, dynamic monitoring, and losslessness. This project will provide a new insight for the study of response mechanisms of marine organisms under heavy metal stress.

镉（Cd）是我国海洋潮间带区域典型的重金属污染物。目前，潮间带复杂环境中的海洋贝类研究是海洋生物研究的难点之一。传统生化检测手段只能获取静态信息，无法开展活体观测。为解决该问题，本项目提出一种利用双光子激发的荧光寿命成像（FLIM）方法动态监测Cd对紫贻贝的毒理作用过程。首先，建立紫贻贝Cd胁迫实验模型，开展mRNA及小RNA基因表达谱测序分析，获得紫贻贝响应Cd胁迫的差异生物标志物；其次，通过基因编辑技术标记生物标志物，利用有机荧光探针标记细胞器，使用Cd探针标记其在细胞内的分布；然后，利用多色荧光显微成像技术获得Cd、生物标志物及细胞器的共定位信息，利用双光子激发FLIM方法获得Cd胁迫过程中在体微环境变化的定量数据，从而在活体、细胞、分子等多层面解析Cd对紫贻贝的毒理效应机制，具有灵敏度高、动态、无损等优点。本项目将为重金属胁迫下海洋生物的应答机制研究提供一种新思路。

海洋污染物不仅危害全球海洋生态系统，而且会通过食物链的富集和放大作用威害人类自身健康。因此，我们亟需可以综合反映水质的理化指标来监测海洋污染情况。本研究选择海洋环境常用环境监测生物紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）和菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）作为研究对象，利用FLIM成像技术研究了重金属对菲律宾蛤仔的毒理学效应，从转录组学的角度对紫贻贝响应重金属胁迫的microRNA（miRNA）进行了深入解析，结论如下：1. miRNA是一类包含18-24个核苷酸的非编码RNA分子，能够通过抑制或增强mRNA翻译来调节真核基因的表达。为揭示紫贻贝中miRNA的组成，我们通过Solexa深度测序技术对紫贻贝软体组织进行了测序。从组织中鉴定了137种紫贻贝miRNA（mg-miRNA）。在mg-miRNA中，有104种在物种间保守，而33种可能具有特异性。一些mg-miRNA，例如let-7和miR-100家族在许多代谢途径中起着关键作用，值得进一步研究。通过对mg-miRNA进行表征并讨论其潜在功能，可为理解紫贻贝的生命过程提供一定基础。2.我们利用Solexa深度测序技术表征了经镉（Cd）暴露后紫贻贝不同组织（整体组织，鳃、消化腺和性腺）中差异表达的miRNA。经Cd暴露96小时之后，在紫贻贝体内发现107种差异表达的已知miRNA和32种新型miRNA。这些miRNA差异表达的靶基因与免疫防御，细胞凋亡，脂质代谢和异种生物代谢有关，并经Cd胁迫后出现显著变化。这些发现为后续紫贻贝中的miRNA的表征及发掘响应镉胁迫的靶基因研究提供了基础。3菲律宾蛤仔常被用于海洋污染监测。荧光寿命显微成像（FLIM）技术与传统光学显微成像方法相比，能够提供更多的生化诊断信息，已成功应用于细胞生物学和临床诊断等领域。本研究利用荧光寿命成像方法，对经砷暴露后的菲律宾蛤仔的鳃和肝胰腺组织进行荧光寿命成像，对得到的荧光寿命图及直方图进行分析。研究发现，与对照组相比，经砷暴露后菲律宾蛤仔组织结构的FLIM图像存在显著差异。综上，荧光寿命显微成像方法可为海洋环境监测及评价提供一种新型量化分析思路。