系统性基因沉默在增强嫁接园艺植物病毒抗性上的研究

园艺植物种类与品种多，易受病毒的危害，病毒病抑制其生长、结果，降低产量、质量。利用基因工程技术提高每一个品种的抗病毒能力，虽可行但费时费力。嫁接是园艺植物繁殖的方法之一，嫁接繁殖时一般同种类中的不同品种采用同一砧木。为了提高接穗抗某一病毒的能力，若只需通过改良砧木，嫁接后就能增强接穗抗该病毒的能力，这将更为高效。本研究以番茄丽春为试材，以黄瓜花叶病毒（CMV）为研究对象，利用系统性基因沉默技术，通过构建CMV 5个基因的ihpRNA表达载体，农杆菌转化丽春，使转化植株产生siRNA，接种CMV，筛选抗性植株。之后以其的T0或T1代为砧木，嫁接野生型丽春、中蔬5号和早粉2号番茄，砧木中的siRNA转运到接穗中，以增强接穗对CMV的抗性。本试验既可进一步验证系统性基因沉默，更是嫁接园艺植物抗病毒方法的新尝试。如获成功，该技术将为嫁接园艺植物的品种改良提供一种全新的思路与方法。

RNA沉默利用负调控手段，在基因的转录和转录后水平，介导的序列特异性的基因沉默。RNA沉默途径具有多样性，涉及的关键基因也比较多，在拟南芥等模式植物上研究的比较清楚。番茄是重要的园艺模式生物，但对其RNA沉默系统的认识还不系统和完整。. 1、本文研究了番茄RNA沉默系统的关键基因：在番茄中鉴定了7个DCL、15个AGO和6个RDR基因。系统进化树分析，认为这些基因均可被分类为4类。比较了这些基因的结构和序列相似性、调查了在番茄基因组上的定位，并且利用网络数据库和半定量RT-PCR，鉴定了不同组织或器官以及在不同非生物胁迫和在TYLCV病毒胁迫下的表达。在非生物胁迫和TYLCV侵染后，发现一些特定基因的表达获得了提高。从SlDCL2s的串联重复和表达模式来看，DCL2家族在番茄进化过程中可能具有重要作用。 . 2、进行了RNA沉默与嫁接技术结合获得病毒(CMV)抗性材料的实践：分别以CMV的5个基因为靶标，通过农杆菌介导的转化，成功获得53株Kan 抗性及PCR阳性植株。通过对扦插苗接种CMV鉴定抗性发现，1A~CP中存在不同程度的抗性，其中1A和3A共有6株、2A有7株、2B有8株以及5株CP转基因番茄展现出对CMV的高抗。本研究利用扦插的方法，获得了大量的砧木后代，在生产上对于抗性材料的繁殖是十分有益的。以高抗的转基因植株作为砧木嫁接非转基因番茄品种，发现其病毒抗性可进行有效传递。而嫁接接穗成功获得病毒抗性，为园艺植物一砧多穗的实践提供的依据。另外，砧木中超表达的NptII基因的mRNA并未在接穗中检测到，这可能为消除消费者对GMO生物安全性的忧虑提供新的途径。 . 本研究的意义在于：1，为理解番茄的RNA沉默体系，研究其关键基因在番茄生长发育或不同逆境条件下的功能，提供了重要信息；2，为理解植物sRNA特征及其功能提供数据；3，为认识Ty-1基因和RNA沉默介导的病毒抗性之间的异同提供了证据；4，实践了RNA沉默技术在病毒抗性上的应用，提出了高效安全的转基因抗病毒新策略。