FOXO1通过调节自噬通路参与小鼠慢性脑低灌注后的微血管损伤与重建

During the process of chronic cerebral hypoperfusion, endothelial cells undergo ischemia and hypoxia injury, but aslo act as a key cell component for microcirculation reconstruction. FOXO1 is the most important subtype of transcription factors class O, and is recently proved to be a key regulator of metabolism, proliferation and vascular growth in endothelial cells. We hypothesized that FOXO1 and its downstream autophagy pathway is activated in cerebral microvascular endothelial cells under chronic cerebral hypoperfusion. The activation maintains cell survival and blood brain barrier function. However, continuous activation will affect the proliferation of vascular endothelial cells and angiogenesis. In this research, we will establish unilateral common carotid artery occlussion model in mice, record the dynamic changes of FOXO1 protein and mRNA level in mouse brain and brain microvascular endothelial cells; construct interferon inducible FOXO1 knockout mice, observe the effects of FOXO1 on apoptosis of endothelial cells, blood brain barrier function and angiogenesis, as well as cerebral blood flow reconstruction after chronic hypoperfusion. To explore the underlying mechanism of FOXO1 in survival and growth regulation of endothelial cells, we will culture the brain microvascular endothelial cells in vitro and observe the effects of FOXO1 and its downstream autophagy pathway on cell apoptosis and tube formation ability during oxygen glucose deprivation. The results of this research will provide an important potential target for the intervention of chronic cerebral hypoperfusion and related diseases.

慢性脑低灌注中血管内皮细胞遭受缺血缺氧损伤，同时又是微循环重建的关键细胞成分。FOXO1是O类叉头框转录因子中最重要的亚型，是内皮细胞代谢、增殖和血管生长的关键调控关卡。我们在前期研究基础上推测慢性脑低灌注后脑微血管内皮细胞FOXO1及其下游自噬通路出现激活，维持细胞存活和血脑屏障功能；持续的激活将抑制内皮细胞的增殖和血管生成。本研究以单侧颈总动脉结扎构建小鼠慢性脑低灌注模型，动态观察小鼠脑组织和脑微血管内皮细胞FOXO1蛋白和mRNA的表达；构建干扰素诱导的FOXO1敲除小鼠，观察FOXO1基因敲除对慢性低灌注后脑血流重建以及脑微血管内皮细胞凋亡、屏障功能、血管生成的影响；进行脑微血管内皮细胞体外培养，在糖氧剥夺模型中观察FOXO1及其下游自噬通路对内皮细胞凋亡、管腔形成能力的影响，探讨FOXO1对内皮细胞存活与生长的调控机制。课题实施将为慢性脑低灌注及相关疾病的干预提供重要靶点。

慢性脑低灌注中血管内皮细胞遭受缺血缺氧损伤，同时又是微循环重建的关键细胞成分。FOXO1是O类叉头框转录因子中最重要的亚型，是内皮细胞代谢、增殖和血管生长的关键调控关卡。深入研究FOXO1在内皮细胞的稳态调节中的作用将有助于阐明脑组织慢性低灌注损伤的内皮细胞相关机制，为其治疗提供潜在的干预靶点。此外，研究表明内皮细胞中FOXO1的表达水平受其mRNA甲基化（m6A修饰）的控制，另一方面褪黑素（Melatonin）可以抑制m6A修饰相关的甲基化，但是褪黑素是否可以调控FOXO1表达参与慢性脑低灌注后微血管损伤和重建尚未见报道。. 本项目建立了脑微血管内皮细胞糖氧剥夺模型和小鼠单侧颈总动脉结扎模型，探讨了褪黑素通过FOXO1参与对慢性脑低灌注后微血管的损伤与重建的调节。我们利用Western blot、免疫荧光等实验方法，证实了糖氧剥夺可以使内皮细胞中的紧密连接蛋白Occludin、ZO-1， 增殖相关蛋白VEGFA表达下调，而线粒体激活的标志蛋白TOM20、凋亡相关蛋白Caspase9、Cle-Caspase9表达上调；我们观察到抑制FOXO1的作用会加重糖氧剥夺对内皮细胞的损害作用。此外，我们发现褪黑素可以上调脑内皮细胞中FOXO1的表达；同时，褪黑素还可以降低受损的内皮细胞中紧密连接蛋白和VEGFA表达的下调程度，以及抑制内皮细胞中线粒体激活和凋亡相关蛋白表达，从而使内皮细胞对缺血缺氧耐受性增加。进一步我们发现，使用了FOXO1抑制剂后，褪黑素对内皮细胞的上述保护作用消失了，证明了褪黑素可能通过激活FOXO1参与对慢性脑低灌注后微血管的损伤与重建的调节。体内实验中，我们还发现了给小鼠静脉注射褪黑素可以明显减轻慢性脑低灌注造成的脑白质脱髓鞘改变，证实了褪黑素可以改善低灌注造成的脑部损害。. 本项目对褪黑素通过FOXO1参与对慢性脑低灌注后微血管的损伤与重建的调节进行了研究。发现了褪黑素可以保护内皮细胞免受缺血缺氧的损害，以及减轻低灌注造成的脑白质损伤，其机制涉及到FOXO1所介导的信号通路。以上结果丰富了慢性低灌注中血脑屏障损伤的机制，同时为褪黑素作为慢性脑缺血性疾病的潜在治疗药物提供了理论依据。