质膜型水通道蛋白基因LpPIP提高多年生黑麦草响应干旱胁迫作用机制研究

多年生黑麦草是广泛分布于温带地区的一种冷季型草坪草。水资源匮乏引起的干旱胁迫是多年生黑麦草生长中最主要限制因素。植物水通道蛋白( Aquaporins, AQPs) 是质膜和液泡膜上专一、高效的水分跨膜双向运输通道, 属于MIP( Major intrinsic protein) 家族。水通道蛋白在植物体内形成水选择性通道, 在细胞生长、气孔运动等过程中调节水分的快速跨膜运输，在响应干旱胁迫中具有重要作用。本研究利用分子生物学和逆境生理学研究方法，从克隆、验证分析多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因（LpPIP）入手，解析植物体内水分运输特性，研究LpPIP在水分胁迫中的应答机理。上述研究有助于深入了解黑麦草响应水分胁迫作用机制，为耐旱育种提供新的思路。申请者多年从事黑麦草生物技术研究，有很好的工作基础，黑麦草质膜型水通道蛋白基因研究国内外尚无报道，故本研究具有良好的可行性和创新性。

通过同源克隆获得黑麦草水通道蛋白LpAQP基因的cDNA全长序列特征，研究其编码蛋白的细胞定位、水分运输功能及其在非生物胁迫下的表达模式，并构建过表达载体转化拟南芥和黑麦草研究其基因功能，揭示出黑麦草响应干旱胁迫的机理。.采用RACE 技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长，结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性。LpAQP（GenBank登录号：JX569791）的开放阅读框（ORF）为 867 bp，编码 288 个氨基酸，蛋白质分子量为 30.7 kD。该基因含有2个NPA单元，6个跨膜区，LpAQP 含有与 MIP 家族完全一致的蛋白质保守区，其氨基酸序列与其它禾本科 PIP 类质膜型水通道蛋白同源性较高。水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。24个物种间的聚类分析表明LpAQP 基因编码的蛋白与小麦（ACZ51371）和水稻（Q7XSQ）质膜型水通道蛋白遗传距离最近。利用基因枪转化法将LpAQP基因与GFP融合的瞬时表达载体（LpAQP::GFP）转入洋葱表皮细胞，对该基因进行亚细胞定位；细胞定位结果确认LpAQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用。Southern杂交结果显示LpAQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝。爪蟾卵母细胞系统显示LpAQP具有介导水分运输的能力。Real time-PCR 分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根，干旱胁迫、盐胁迫或ABA处理会导致LpAQP表达量先上调后下降。为了更充分证明LpAQP基因对非生物逆境的响应，我们又转化了野生型酵母菌，结果表明，转LpAQP基因酵母与转空载酵母相比，无论在氯化钠胁迫下还是山梨醇胁迫下，转LpAQP基因酵母在高浓度（NaCl>1.0mol/L；山梨醇>1.8mol/L）胁迫下生长情况均强于转空载酵母。为了进一步研究基因的功能，构建了LpAQP基因的过表达载体，并转化了拟南芥。与对照植株相比，LpAQP的过表达植株在干旱胁迫下发芽率和存活率都提高。转基因拟南芥植株在干旱胁迫下其相对含水量 (RWC) 高于对照植株，而丙二醛 (MDA) 含量则较低。综上可知，黑麦草水通道蛋白基因 LpAQP是可能通过提高植物含水量和维持水分平衡的方式参与番茄幼苗根系中的水分运输。