抗肿瘤药物链黑菌素生物合成的后修饰过程及其代谢过程研究

Streptonigrin is an antitumor antibiotic produced by Streptomyces flocculus. Streptonigrin possesses a varity of biological activities, such as antibacterial, antivirus, and antitumor activity. It has been confirmed to be effective against leukemias, melanomas, and lymphomas in clinic use. In view of its unique structure and excellent bioactivities, we carried out the study on the biosynthesis of streptonigrin. We determined the biosynthetic gene luster of streptonigrin which is comprised of 48 genes involved in the biosynthesis of streptonigrin. We deduced the biosynthetic pathway of the streptonogrin based on genetic, biochemical and structural data, and we identified lavendamycin as the biosynthetic intermediate of streptonigrin. We proposed that the maturation of streptonigrin from lavendamycin via 3 steps of oxidation and 3 steps of methylation that are referred to the post modifications. In this project, we will focus on these steps of oxygenations and methylations, determine the enzymes and substrates and create a correspondence relationship between the reaction with proteins and genes. The obtained results will guide to produce the synthetic intermediates or ananlogues. In addition, the multi-scale changes to the regulatory factor will be adopted to improve the yield of the intermediates in the biosynthetic pathway. We also combine the genetic and chem-enzymatic means to create the structural diversities of streptonigrin.

链黑菌素是由一株绒毛链霉菌产生的抗肿瘤抗生素，它具有广谱抗肿瘤活性，对白血病、黑素瘤、淋巴瘤等均有较好的疗效。基于链黑霉素新颖的化学结构及显著的生物活性，我们开展了链黑霉素的生物合成研究，已经定位了48个基因与链黑菌素生物合成相关，推理了生物合成途径，鉴定了淡紫醌霉素是链黑菌素生物合成的中间体。自淡紫醌霉素需经过3步氧化和3步甲基化过程（我们称为后修饰过程）才能完成链黑菌素的生物合成，该项目将着眼于阐明后修饰过程的酶催化反应，建立反应与蛋白和基因之间的对应关系，以指导通过代谢工程手段来获得合成中间体或类似物。同时，将多尺度地改变合成途径中的调控因子来提高各中间体的产量，并结合遗传学手段和化学酶法来创造链黑菌素的结构多样性。

链黑菌素是一个多官能团氨基喹诺啉类生物碱抗生素, 具有广谱的抗菌活性,对阳性菌、阴性菌和真菌都具有很强的抑菌活性，并且具有抗病毒活性。最重要的是链黑菌素具有广谱的抗肿瘤活性，特别是对白血病、淋巴瘤和黑色素瘤具有很好的临床疗效，但是由于其显示出持续的骨髓抑制毒性，导致该抗肿瘤药物没有得到临床上的广泛应用。通过系统的体内遗传学和体外生物化学研究，基本建立了基因-酶-反应-结构之间的一一对应关系，然后利用现代微生物遗传学技术构建特定基因的失活突变菌株，发酵突变菌株，并经过分离纯化，利用光谱学技术对这些化合物进行了结构鉴定，一共获得了近20个链黑菌素类似物，并对部分化合物的抗肿瘤分析发现，三个类似物具有与链黑菌素相当的抗肿瘤活性，其中一个显示出对口腔癌具有专一性，这为链黑菌素进一步开发抗肿瘤药物提供了物质基础。.链黑菌素和链黑菌酮分别分离鉴定自不同的链霉菌，但是它们的结构相似性，说明它们应该是同一个生物合成途径的产物。通过筛选不同的催化氧化反应的酶，特别是依赖于黄素的单加氧酶，让我们发现了一个黄素在还原条件下催化的链黑菌素氧化脱羧反应，生成链黑菌酮的反应。尽管有大量研究表明黄素不能作为有机小分子催化反应，但是我们的工作是首次发现这样的反应，为了阐明黄素催化反应的机理，我们选择了一系列在羧基邻位和对位连用给电子基团或者拉电子基团的吡啶羧酸衍生物以及芳香羧酸衍生物，初步推测可能是经历了一个氧化-脱羧的协同反应过程。此外，为了排除自由基反应的可能性，我们使用自由基捕获剂或者单独使用能够产生羟基自由基、过氧阴离子自由基的反应体系均不能影响反应。因此黄素依赖的链黑菌素到链黑菌酮的的反应机理得到了阐明。此外，我们还阐明了一个水解酶的晶体结构发现了一个全新的底物结合模式。并进一步发现四个羧甲基转移酶催化的新颖的保护机制。..这些研究不仅为利用生物技术去创造复杂结构化合物的衍生物奠定了理论与技术基础，而且发现了多个新颖的酶催化反应，研究它们的催化反应机理，为将这些酶开发成高效催化剂提供基础。