EVER1基因突变与疣状表皮发育不良患者HPV易感机制的相关性研究

本课题以正常健康人为对照、疣状表皮发育不良（EV）患者为研究对象，采用体外培养人外周血单核细胞衍生树突状细胞（DC）、特异性HPV质粒重组与转染、免疫荧光定位染色、RT-PCR及ELISA等方法，从EV患者外周血EVER1基因表达与EV患者感染的HPV亚型入手，研究EV患者、正常健康人外周血DC转染特异性HPV质粒前后（1）细胞内EVER1基因表达及定位；（2）DC数目、形态变化；（3）DC分化成熟标记（CD1a、CD83）变化；（4）DC启动和调节免疫反应过程中细胞表面活性分子(MHC I、CD80、CD86)的表达及分泌细胞因子(IL-10、IL-23、IL-18)的变化，初步探讨EVER1基因突变对EV患者DC活性及功能的影响，揭示EV患者对HPV易感的分子生物学基础；探讨EVER1基因是参与DC识别、处理并呈递HPV抗原的免疫相关基因，为进一步治疗提供理论基础和思路。

本课题以正常健康人为对照、疣状表皮发育不良（EV）患者为研究对象： （1）通过体外培养人外周血单核细胞衍生诱导树突状细胞（DC），观察其形态数目；（2）通过直接测序法对收集到的EV患者皮损中的HPV进行基因分型研究，根据测序得到的型别和文献中的常见型别，设计特异性引物，通过型特异性PCR来验证和补充测序结果；（3）以空白组为对照，探讨三种剂量中波紫外线照射角质形成细胞，在照射后的第4小时使用蛋白免疫印迹法测定细胞总蛋白中IκBα及NF-κB p65的表达水平。并对人原代角质形成细胞进行50mJ/cm2中波紫外线照射，测定四个时间点（2、4、8、12h）IκBα及NF-κB p65的表达水平，观察NF-κB p65及其抑制因子IκBα表达水平的调控效应。结果发现：(1) EV患者外周血单核细胞诱导衍生的未成熟树突状细胞的数目和形态均在正常范围；（2）25例EV标本测序结果阳性为23例，扩增失败2例；69.57%（16/23）感染高危型HPV，其中HPV-5为47.83%（11/23），与既往报道类似；（3）50mJ/cm2UVB照射后4h，原代角质形成细胞中，IκBα表达水平较对照细胞(0.356±0.041)显著降低(0.128±0.031，t=43.879,P<0.05)，NF-κB p65较对照细胞（0.102±0.028）也较存在一定程度的降低（0.063±0.032，t=16.887，P<0.05），细胞系中IκBα的表达水平较对照细胞（0.289±0.037）轻度下调（0.123±0.031，t=31.074，P<0.05），但NF-κB p65的表达水平无明显变化（P>0.05）。50mJ/cm2UVB照射原代细胞后，相对于对照组细胞（0.208±0.031），IκBα表达水平在照射后2h开始下调（0.140±0.034，t=17.554,P<0.05），并且随照射后时间推进而下调效应更为显著；NF-κB p65的表达水平在8h、 12h较对照细胞下调（t8h=36.671，t12h=28.707，P<0.05），随着时间的推进下调效应无明显改变；Phospho-IKKα/β（ser176/180）、IKKβ、Phospho-IKBα（ser32）、Phospho-NF-κB p65（ser536）表达量均无明显改变（P>0.05）。