植物病毒侵染的植物亚细胞内谷胱甘肽和活性氧的实时活体生物传感成像

Both glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) play pivotal roles in defensing the pathogen infection. The present analysis methods cannot provide in vivo, real-time and dynamic information about this two small molecules. In order to investigate the plant virus infection and plant defense mechanism, we plan to design the fusion of glutaredoxin (Grx) and peroxiredoxins (Prx)，respectively to roGFP2 to facilitate specific real-time equilibration between the sensor protein and the glutathione redox couple and H2O2.The biosensor will be targeted to chloroplast, mitochondrial and cytosol with the help of some transit peptide, which will make the exact sub-cellular detection of GSH and ROS. Transgenomic tobacco and Arabidopsis expressing roGFP will be obtained with this biosensor plasmid. Combined the transcriptome and metabolomic analysis of the chlorophyll biosynthesis in different symptoms development, the cucumber mosaic virus infection mechanism based on redox is expected to present. Moreover, the transgentic plants expressing the biosensors can be used for the study of other pathogens such as bacterial, phytoplasma, fungi and other plant virus. This temporal resoluted and sensitive biosensor will facilitate the observation of redox changes associated with plant virus, bacterial and fungi infection.

谷胱甘肽和活性氧是植物在抵御病原物侵染时起着重要信号传导作用的小分子化合物。现有分析方法都难以对两者进行实时、动态、灵敏的分析。为了研究植物病毒侵染和植物抗性机理，本项目拟用对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(redox GFP,roGFP)构建靶定于线粒体、叶绿体和细胞质的生物传感器Grx-GFP 和Prx-GFP,分别用于实时动态监测谷胱甘肽和过氧化氢。把此生物传感器转入植物，得到表达roGFP 的转基因烟草和拟南芥。以黄瓜花叶病毒为模式植物病毒，一方面可用于实时动态监测植物病毒侵染植物后，其体内的谷胱甘肽和活性氧随症状发展的产生情况，另一方面可用于筛选植物病毒真正引起黄化症状的基因。结合该病毒侵染过程中叶绿素的生物合成和叶绿体蛋白质变化的转录组和代谢组学分析，提出黄瓜花叶病毒的致病机理。本项目所构建的质粒和转基因植物材料还可用于其它病原物致病机理的研究，具有广阔的应用前景。

谷胱甘肽和活性氧是植物生长不可或缺的小分子化合物，起着重要的信号传导作用，对两者的实时、动态分析是研究病原物侵染和植物抗性机理的关键。本项目主要研究了三个内容：1.构建了靶定于线粒体、叶绿体和细胞质的氧化还原绿色荧光蛋白(redox GFP,roGFP)和生物传感器Grx-roGFP的表达载体,用于实时动态检测植物细胞体内的过氧化氢和氧化还原状态；2.采用荧光寿命成像、透射电镜、高效液相色谱和荧光光谱等技术，研究了植物病毒侵染的烟草叶片中叶绿素的荧光寿命变化情况和活性氧的产生情况；3.对植物病毒侵染的烟草叶片进行了转录组和代谢组学分析。我们成功构建了roGFP的几种表达载体，并成功在植物细胞质，叶绿体和线粒体中表达。在叶绿体和细胞质中的roGFP对过氧化氢和DTT都有响应。通过荧光寿命成像，我们发现植物病毒侵染的黄白化叶片具有明显短的叶绿素荧光寿命。对植物病毒侵染的烟草几个时期的叶片进行转录组学和代谢组学发现，光合作用和氧化还原状态的基因转录有明显改变，且在明脉、黄白化、初步恢复时期的氨基酸代谢物水平大大增加，而碳氢化合物代谢物水平减少。研究结果表明，植物病毒侵染早期产生的活性氧可能作为信号分子引起植物的防御产生黄化症状，减少叶绿素对光的吸收以减少过量自由基的产生，从而减少对植物细胞的损伤。本项目所构建的质粒和转基因植物材料还可用于其它植物病毒、细菌、真菌等病原物致病机理的研究，具有广阔的应用前景。