基于金属纳米簇电致化学发光特性的激酶活性检测研究

In this project, for the analysis of protein kinases associated with critical diseases, the substrate peptides which are targeted by the specific protein kinases are screened and designed, and used as templates and stablizers to synthesize electrochemiluminescent metal nanoclusters with high luminous efficiency and good stability. The electrogenerated chemiluminescence behavior and mechanism of metal nanoclusters will be studied in detail. The important physical and chemical properties of energy transfer and material transmission are effectively converted into photoelectric signals through the photoelectric effects of nanoclusters in the biomolecular recognition process. Based on this, a series of electrochemiluminescent sensing strategies (signal on, signal off, and dual-signal ratiometric approaches) for highly sensitive assay of protein kinases activity and inhibitions can be developed by taking advantages of cationic mediated, biotin-streptavidine mediated, antibody-antigen mediated and S-Au mediated electrogenerated chemiluminescence signal transition and signal amplification (or signal decrease) of metal nanoclusters. The sensing platform will be further used to detect protein kinases activity in biological samples and screen potential inhibitors, which is of great significance for the development of targeted therapy, clinical diagnosis, and studies of cellular signal transduction pathways.

本项目拟针对与重大疾病相关的蛋白激酶，设计和筛选蛋白激酶特异性识别的底物多肽，并以多肽为模板合成具有优良电致化学发光（ECL）特性的金属纳米簇，探讨金属纳米簇的电化学发光机制与构效关系。在研究纳米材料与生物分子相互作用机制的基础上，实现生物分子的定向偶联和有序组装，制备纳米生物复合探针和生物传感界面，研究靶标蛋白激酶与底物多肽的相互作用及其对金属纳米簇光电性质的影响，将该特异性生物识别过程有效转换为金属纳米簇的光电信号变化，获取金属纳米簇与蛋白激酶活性之间的识别传感规律。利用活性氧对金属纳米簇ECL的猝灭、金属纳米簇生物复合探针的ECL增强、纳米材料对金属纳米簇阴极ECL猝灭和对鲁米诺阳极ECL增强等效应，构建基于金属纳米簇ECL信号"关"、信号"开"和双信号比率放大等策略的高灵敏性和选择性蛋白激酶活性检测及抑制剂筛选传感平台。

以蛋白激酶特异性识别的底物多肽为模板合成金属纳米簇，利用生物识别原理和纳米材料的光电效应，构建了几类光电信号“开”、信号“关”、双信号比率放大等策略的蛋白激酶活性传感平台及抑制剂筛选方法。围绕以上内容，本项目主要开展了以下方面的研究工作：（1）利用AuNCs对g-C3N4的ECL信号增强效应，建立了基于ECL信号“开”的PKA活性检测及抑制剂筛选方法。此外，基于g-C3N4与Au NPs之间的ECL-RET作用对g-C3N4的ECL信号的猝灭效应，建立了基于ECL信号“关”的PKA活性检测方法。（2）制备ECL发光强且稳定的Au-g-C3N4，As(III)与Ru(bpy)32+分别通过ET和ECL-RET作用协同猝灭Au-g-C3N4的ECL信号，同时产生新的Ru(bpy)32+的ECL信号，建立了双波长比率ECL方法超灵敏检测As(III)。（3）以GQDs为ECL发光试剂，利用GO对GQDs的ECL信号的猝灭作用，建立了基于ECL信号“关”的CK2活性检测方法。此外，分别以GQDs和luminol为阴极和阳极ECL试剂，在Au NPs的介导下，同时实现了GQDs阴极ECL信号下降和luminol阳极ECL信号增强，建立了双电位比率ECL传感方法检测PKA活性。（4）巯基磷酸化多肽修饰电极在Na2S2O8-O2中的ECL信号很弱，当通过Au-S键将Au NPs捕获到电极表面时，ECL信号大大增强，建立了PKA活性超灵敏检测方法。（5）利用去甲肾上腺素的自聚合作用制备Fe3O4@PNE NPs，通过螯合作用结合Ti4+形成Fe3O4@PNE-Ti4+，基于Ti4+与磷酸化多肽和未磷酸化多肽的作用差异实现二者分离，建立了基于Fe3O4@PNE-Ti4+功能化PDMS芯片的PKA活性检测方法。（6）以CK2的底物多肽为模板制备Au NCs，利用磷酸根与Zr4+的相互作用，建立了以Au NCs为探针的CK2活性检测方法。此外，基于CPY对多肽的水解以及PKA存在与否时Au NCs荧光的差异，构建了Au NCs荧光信号“开”的PKA活性检测方法。在此基础上，分别以PKA和CK2的底物多肽为模板制备Cu NCs和Au NCs，结合CPY酶切作用，建立了同时检测PKA和CK2活性的新方法。项目已按计划完成，发表SCI论文30余篇，授权发明专利13项，申请发明专利5项。