青蒿素生物合成途径在蓝藻Synechocystis PCC 6803中的构建及优化

As the drug of first choice for the treatment of malaria, artemisinin has enormous market demand, by which supply depends mainly on plant tissue extraction and semi-biosynthetic process. However, the long cycle of planting will easily lead to the fluctuation of market price, while the microbial cell factories represented by yeast can only synthesize artemisinin precursors, the cost of subsequent chemical synthesis is still high. Therefore, the development of feasible chassis cells for artemisinin total biosynthesis has great social significance. Previous studies have shown that cyanobacteria are capable of producing different types of artemisinin precursors through engineering metabolic pathway, and they can also produce singlet oxygen, the excited state oxygen molecule, which is the catalyst that mediates the transformation of precursors to artemisinin. Therefore, we put forward the hypothesis that chassis cells such as cyanobacteria are advantageous in artemisinin synthesis. This study intends to construct the heterologous artemisinin synthetic pathway in the model strain of cyanobacteria, Synechocystis PCC 6803, accompanied with the optimization of fermentation conditions to raise the titer of artemisinin precursor. Investigating the relationship between oxidative stress factors and endogenous singlet oxygen content to discover the specific conditions of artemisinin synthesis in vivo. With applying the metabonomic analysis, we can elucidate the metabolic regulation mechanism of artemisinin-producing strain, which provide the rationale for rational design of artemisinin synthesis pathway.

青蒿素是治疗疟疾的首选药物，市场需求量巨大，其供应主要依赖于植物提取和生物半合成工艺。但是，植株种植的漫长周期容易导致市场价格的波动，而以酵母为代表的微生物工厂只能合成到青蒿素的前体，后序的化学合成仍面临成本较高的问题。因此，开发能够进行青蒿素全合成的底盘细胞具有重要的社会意义。申请人通过前期研究发现，蓝藻能够通过代谢途径改造获得青蒿素的不同前体，并且蓝藻能够产生单线态氧，这类激发态氧分子正是介导前体向青蒿素转化的催化剂。因此我们推测蓝藻这类底盘细胞在青蒿素合成方面将具备一定的优势。本课题拟在蓝藻模式菌Synechocystis PCC 6803中构建异源青蒿素合成途径，并对发酵条件进行优化以提高青蒿素前体物的浓度；考察氧化应激因子与内源单线态氧含量之间的关系，探索实现青蒿素体内合成的特殊条件；并结合代谢组学分析对青蒿素合成蓝藻的代谢调节机制进行解析，为青蒿素合成途径的理性设计提供依据。

青蒿素作为全世界最有效的抗疟疾药物，具有很高的临床应用价值。目前，青蒿素的主要来源是从黄花蒿中提取或通过化学方法合成，但均存在一定的缺点，如产率低、步骤繁琐等。随着合成生物学的发展，用微生物宿主细胞进行青蒿素的异源生物合成逐渐成为研究热点，生物合成具有周期短、污染低等优势，在常用模式菌株如酿酒酵母中，已经实现了青蒿素前体物青蒿酸的商业化生产,但在微生物中实现青蒿素的全合成仍然面临着诸多困难。蓝藻是一种光合自养微生物，其能量代谢模式与植物相近，但在繁殖速度和遗传操作等方面具有很大的优势。而且，蓝藻活跃的萜类代谢途径和内膜系统为青蒿素的合成提供了丰富的五碳骨架和氧化环境。本项目利用同源重组方法将三种异源青蒿素合成基因导入蓝藻模式菌株Synechocystis sp. PCC6803的基因组中，并在常规光照培养条件下在工程藻株中检测到紫穗槐二烯和青蒿酸。经过对不同培养条件的尝试，我们发现高温热激能够显著提高青蒿素前体物的滴度，并能够成功诱导青蒿素的合成，青蒿素浓度为0.115 mg·g-1干重。这是首次在微生物中表达完整的青蒿素合成途径，证明了将用于萜烯类生物合成的MEP通路的中间体FPP转化为青蒿素的可能性，实现了青蒿素异源全合成的重大突破。通过进一步的研究发现，工程藻株能够成功合成青蒿素的关键在于其在热胁迫条件下会产生大量单线态氧，而单线态氧可能介导了青蒿素前体在氧气和光的存在下转化为青蒿素的非酶促反应。为了更好地研究青蒿素在蓝藻底盘细胞中的合成调控机制，我们对青蒿素合成的上游和下游途径进行了模块化改造，最终将青蒿素的产量提高了近3倍，达到0.378 mg·g-1干重。这项工作填补了长时间以来微生物合成青蒿素的空白，显示了蓝藻作为细胞工厂去生产植物来源天然药物等高附加值化学品的潜力和可行性。