NiSOD在维护聚球藻CC9311光合机构运转中的功能研究

NiSOD是一种新型超氧化物歧化酶，目前在高等植物中还未有报道，而聚球藻CC9311是已测序的光合生物中唯一含有两个NiSOD编码基因（SYNC0755和SYNC2434）的物种。由于光合电子传递链是植物细胞中活性氧的主要产生部位，因此本项目拟从以下几方面揭示NiSOD对聚球藻CC9311光合机构运转的影响机理。采用免疫印迹和63Ni放射自显影方法，在不同细胞组分中鉴定SYNC0755和SYNC2434编码产物；采用痕量金属洁净技术，从生理水平研究镍饥饿对聚球藻CC9311光合作用与抗氧化系统的影响；通过插入失活构建SYNC0755和SYNC2434基因的突变株，分析突变株在光氧化胁迫和光抑制条件下的表型，从分子水平阐明这两个基因在维护聚球藻CC9311光合机构运转中的功能。本研究将拓展人们对光合生物抗氧化系统的认识，为NiSOD在农作物叶绿体基因工程中的应用提供理论依据。

以海洋聚球藻CC9311作为实验材料，对两个可能的NiSOD和一个潜在的Cu/ZnSOD进行了鉴定和胞内定位研究，并从生理和分子水平阐明光合生物中它们在维护光合机构运转中的功能。..首先，原核表达两个潜在的NiSOD编码基因和一个潜在的Cu/ZnSOD编码基因，分别制备多克隆抗体。通过免疫印迹反应发现聚球藻CC9311中SYNC2434基因不表达，结合SOD活性染色发现SYNC0755编码NiSOD，而SYNC1771编码Cu/ZnSOD。通过超速离心和蔗糖密度梯度离心分离聚球藻CC9311细胞组分，结合免疫印迹反应，发现NiSOD为可溶性蛋白，位于细胞质，而Cu/ZnSOD在细胞质和类囊体膜上均有分布。..其次，两种SOD必须螯合金属离子镍或铜才有催化活性，因而分析了镍和铜饥饿条件下聚球藻CC9311的生长和光合作用，发现在含镍和铜培养基中生长速率最大，但是线性光合电子传递速率在铜饥饿时比含镍和铜培养时显著加快，提出聚球藻CC9311中也存在PTOX类似物对线性电子传递链上的电子进行分流。与含镍和铜培养时相比，铜饥饿对聚球藻CC9311的PQ氧化无影响，QA氧化加快，而镍饥饿对聚球藻CC9311的QA氧化没有影响。对两种SOD进行蛋白定量分析，发现镍诱导NiSOD表达，铜诱导Cu/ZnSOD表达，但缺铜不能显著诱导NiSOD上调表达。..接下来，利用模式蓝藻集胞藻PCC 6803研究SYNC0755和SYNC1771基因的功能，构建了sod B-突变株（不完全突变）和PpetE调控的FeSOD突变株（完全突变）。将SYNC1771基因整合到sod B-突变株基因组上，以互补缺失的FeSOD功能，发现互补株中Cu/ZnSOD在细胞质和类囊体膜上均有分布。比较野生型、sod B-突变株与Cu/ZnSOD互补株，发现Cu/ZnSOD能互补FeSOD功能，有效地抵御MV和NF产生的氧化胁迫，且在抵御高光产生的氧化胁迫方面比FeSOD更有优势。由于蓝藻产生成熟的NiSOD需要经历复杂的翻译后加工过程，已将聚球藻CC9311的NiSOD、镍转运子SYNC0753及两个分子伴侣蛋白（SYNC0754和SYNC0756）在集胞藻PCC 6803中共表达。同时解决了长期困扰课题组的关键难点问题，构建了聚球藻CC9311的SYNC0755-基因突变株，目前已获得部分分离的敲降株。