小胶质细胞转核P2X7受体介导的生物学效应的研究

活化态小胶质细胞（MG）在脑外伤、缺血、炎症、退行性病发病过程中起重要作用，病变局部及邻近区受损细胞释放出大量ATP，后者通过P2X受体激活局部MG。过度激活的MG会对局部细胞造成二次损伤。因此查明ATP激活MG的机制将为辅助治疗上述疾病提供依据。研究表明ATP可通过P2X7受体激活MG。我们的实验表明正常MG表达的P2X7受体位于胞浆和胞膜上，高浓度ATP刺激后P2X7受体短时间内会转移到核膜和核质网上，提示转核的P2X7受体可能参与MG的激活过程。钙离子相关通道转核参与调节细胞功能活动还未见报道。本课题将进一步用钙离子成像等技术证明ATP通过转核P2X7受体调节核钙信号；用免疫组织化学、蛋白印记和RT-PCR技术寻找已知的与P2X7受体相关的信号分子；用液相二维胶分离和质谱鉴定技术寻找新的可能与P2X7受体相关的信号分子，查明转核后P2X7受体影响MG功能活动的信号转导途径。

正常条件下P2X7受体位于小胶质细胞的胞膜和胞质。在高浓度ATP刺激后部分细胞P2X7受体在短时间内出现明显转核现象，随着刺激时间的延长，P2X7受体转核的细胞逐渐增多；激光共聚焦显微镜断层扫描技术提示转核的P2X7受体位于核膜和核质网上，这种现象可被P2受体拮抗剂(PPADS)所阻断；用P2X7 受体不同区段的抗体证实P2X7 受体是整体转移到核内，因而可以保持离其子通道特性；在P2X7基因的C端连接上EGFP转染的HEK293细胞，这些转染的P2X7-EGFP基因的HEK293细胞在ATP刺激后也观察到了EGFP转核现象。. 首先用了较长的时间分离纯化有活性的小胶质细胞核。再用钙离子成像技术检测检测转核P2X7 受体是否调节核钙信号，应用了P2X7 受体激动剂ATP， BzATP等没有发现明显的核钙信号变化，经过长时间的无数次试验均没有发现P2X7 受体激动剂能引起核钙信号的变化。因此目前认为转核的P2X7受体可能没调节核钙离子信号的功能。用酵母双杂交方法发现：P2X7受体 C端与一转核穿梭因子和蛋白水解酶，以及几个转录因子有强的相互作用，提示P2X7受体C端可能剪切后，在转核穿梭因子的帮助下入核，调节基因转录，从而激活小胶质细胞。. 此外我们发现ATP通过P2X7受体参与了缺血再灌注后海马CA1区锥体神经元的迟发性死亡：缺血再灌注后海马CA1区小胶质细胞P2X7受体表达水平升高，P2X7受体升高发生在锥体神经元迟发性死亡之前。静脉注射BBG或腹腔注射A74003（P2X7受体拮抗剂）后，可部分抑制MG激活和部分挽救海马CA1锥体神经元。ATP经P2X7 受体激活小胶质细胞可能与ERK通路相关。小胶质细胞微泡产生可能与DND相关，P38 通路参与了小胶质细胞微泡脱落。BBG和A74003能明显改善缺血再灌注大鼠行为学的影响。上述实验结果表明ATP通过P2X7参与了缺血再灌注后海马CA1锥体神经元的凋亡，P2X7受体将成为治疗靶点，其拮抗剂将有助于缺血再灌注后的神经保护，为临床治疗提供直接依据。