重组几丁质酶磁性固定化载体的构建及结构与效果分析

植物几丁质酶在真菌病害发生及植物抗病性方面起着重要作用，但在分离、纯化及在保存过程中极易受pH、温度、重金属离子、氧等因素的影响，导致活性降低，从而缩短使用寿命，限制了几丁质酶的研究与应用。本项目拟采用带有特殊功能基团（-COOH、-NH2和环氧基等）的磁性载体对重组几丁质酶进行固定化，分析磁性载体对重组几丁质酶的固定化能力及固定化酶的酶学性质，探索重组几丁质酶快速分离、纯化及保持酶活的新途径，以期提高酶活性收率，延长半衰期，为几丁质酶在农产品采前及采后真菌病害防治领域的应用提供理论依据和技术支持。本研究对于丰富酶的磁性载体固定化理论，推动几丁质酶制剂在生命科学、医学、化工、农业及环境科学等方面的应用都具有重要意义。

本项目按照合同规定以毕赤酵母获得高表达量的重组几丁质酶为研究对象。采用化学共沉淀法制备了磁性微球，并通过共价结合、分散聚合、溶剂热还原法构建了三种不同功能基团（氨基、羧基和环氧基）的磁性纳米载体，实现了将重组几丁质酶从粗酶液中快速分离；并确定了最佳固定化条件，分析了功能磁性载体的固定化能力、固定化几丁质酶的酶学性质（热稳定性、贮藏稳定性和重复使用性，并研究了固定化几丁质酶对果蔬采后病原菌的抑制效果。本项研究为重组几丁质酶在果蔬采后病害防治领域的广泛应用提供了理论依据和技术支持。. 采用热溶剂法制备表面羧基化的磁性载体，羧基化后的磁性微粒平均直径200nm。在固定温度为25℃、pＨ为6、固定化时间7ｈ时，固定后的相对酶活性最高。在此条件下，固定化效率为64.43%，纯化倍数为3.47； 采用改进的化学共沉淀法合成了Fe3O4的磁性微球，以此为核，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)制备了氨基化磁性载体，粒径为30 nm-100 nm；固定化pH为8，固定化时间5 h时，固定化效率为61.99%，纯化倍数为6.80； 采用Fe3O4磁性微球为核，聚乙二醇（PEG）为分散介质，聚乙烯毗咯烷酮（PVPK-30）为稳定剂，甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂、偶氮二异丁睛（AIBN）为引发剂，制备了环氧基化磁性载体(P-type)，直径约为100 nm，固定化pH为6，固定化时间9h时，固定化效率69.18%，纯化倍数为6.89；。固定化重组几丁质酶高温60℃保温1h后，剩余酶活力都在80％以上；低温冷藏5d后，剩余酶活大于89.4 %；重复利用5次后，剩余酶活仍然保持在66 %以上；即固定化酶较粗酶液有更好的热稳定性、贮藏稳定性和重复使用性。. 固定化几丁质酶与游离几丁质酶均对灰霉病原菌具有抑制活性，随着酶贮藏天数的增加，抑制率降低，固定化酶放置2-6d对灰霉病原菌仍有较强的抑制作用，但是游离酶经过放置后其对灰霉病原菌菌丝的抑制作用明显降低，放置4d的游离几丁质酶对灰霉病原菌菌丝的抑制率降到了5%，6d时更是完全丧失了酶活，对菌丝的抑制率降为0%，相比之下，固定化几丁质酶的抑制率下降缓慢，6d时抑制率仍有17%，这表明固定化几丁质酶不仅能够保持几丁质酶的酶活性，还提高了酶的稳定性，延长了酶的作用时间。