Nek2调控β-catenin促进肝癌转移的分子机制研究

Wnt/β-catenin signaling is highly associated with cancer progression. As a crucial modulator developmental and homeostatic processes, β-catenin is an integral component of cadherin-based adheren junctions, and the key nuclear regulator in the nucleus. Dysfunctional β-catenin often results in cancer and metastasis, and post-translational modifications of β-catenin continue to play indispensable roles in cancer metastasis. β-catenin is a substrate and binding partner for Never-In-Mitosis-A-related kinase 2 (Nek2), but the functional significance of Nek2-induced β-catenin phosphorylation is still unknown. Interestingly, our preliminary studies found abnormal expression of Nek2 in hepatocellular carcinoma cell lines, and significantly decreased migration in cells depleted of Nek2. Based on these results, we want to elucidate the function of Nek2-induced β-catenin phosphorylation, moreover, to reveal the clinical relevance in hepatocellular carcinoma.

Wnt/β-catenin信号通路与肝癌的发展密切相关，β-catenin作为一个主要的效应分子，既能参与形成细胞间紧密连接的主要结构，又能入核调控靶基因的表达。β-catenin与恶性肿瘤的发生发展密切相关，对该分子功能的调控必将对肿瘤的转移产生非常大的影响。Nek2激酶可以磷酸化底物β-catenin，但是Nek2介导的β-catenin磷酸化所产生的生理效应至今未有研究。初步研究显示：敲减内源Nek2明显减弱细胞的迁移能力，同时我们在高转移性的肝癌细胞系中检测到Nek2的高表达。基于此，课题组将首次研究Nek2介导的β-catenin磷酸化在肿瘤转移中发挥的作用。我们将利用生物学手段找到β-catenin磷酸化位点，并研究Nek2介导的β-catenin磷酸化产生的生理效应。在此基础上，课题组结合临床数据，揭示Nek2在肿瘤转移过程中的作用，为肿瘤的防治提供理论依据。

肝癌（HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，将近一半的肝癌病例都发生在中国，Wnt/β-catenin信号通路是近年来肿瘤生物学领域研究的热点，也是肝癌发生过程中一条重要的信号通路。本项目原定揭示磷酸激酶Nek2对β-catenin的调控机制以及在肝癌发生过程中的作用，而在项目刚刚获批时，已有文章报道了Nek2磷酸化β-catenin的位点以及调控蛋白功能机制。围绕肝癌发生机制的研究方向，课题组改变策略，利用CRISPR/Cas9技术建立小鼠肝癌成瘤模型，以高通量的方式寻找促进肝癌发生的功能基因组合，揭示肝癌发生的机制。. 主要研究内容包括：1筛选肝癌关键驱动基因，构建gRNA个性化文库；2鉴定gRNA文库的工作效率；3尾静脉高压注射，构建小鼠成瘤模型；4对肝脏结节深度测序测序，寻找突变组合；5绘制成瘤图谱，揭示肿瘤形成机制。. 重要结果：1根据近年测序报道的重要肝癌相关的肿瘤抑制因子突变谱和细胞内多种信号通路中关键节点因子，构建靶向34个肝癌驱动基因的gRNA文库；2开发了一个可以检测gRNA切割效率的体外报告系统，验证了文库中gRNA的工作效率，对工作效率差的gRNA进行替换；3对成瘤条件进行摸索，寻找到最佳成瘤的gRNA浓度，成功在小鼠中构建肝癌成瘤模型，成瘤时间缩短至2-3月；4成功分离多只小鼠的肝脏肿瘤结节，对编辑位点进行深度测序，获得突变谱；5将结节分成不同小块，或将原代肿瘤细胞分离培养，进行单细胞测序，获得突变谱。. 近年来大量的测序结果发现了许多癌症发生的相关基因突变，但是这些基因之间的相关性如何确无法得知。一般基础研究也只能覆盖一个或者几个基因之间的联系。而基于CRISPR的高通量筛选工具，可以利用小鼠本身，自然地筛选出成瘤的基因突变组合，揭示出不同基因之间的相关性，最重要的是实现了高通量。同时通过结节分离和单细胞分离测序，我们能够发现肿瘤形成过程中的特点。