温差骤变胁迫对中华鳖肠道组织分子免疫与肠道微生态系统的影响

Reptiles are frequently stressed by abrupt temperature changes in nature. However, to our knowledge, there is no report concerning the changes of mucosal immunity and intestinal microecology of the reptile after this stress, especially at the molecular level. Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) is a representative species of reptiles as well as an important commercial species in aquaculture industry in China. A great amount of Chinese soft-shelled turtles were observed to be dead following the abrupt temperature changes, and the mechanisms of this remains unknown. It is very likely that the alteration of mucosal immunity and intestinal microecology contribute to this. With the application of released Chinese soft-shelled turtle genome information, we plan to evaluate its mucosal immune response at the molecular level post abrupt temperature changes. Meanwhile, the intestinal microflora will also be determined with 16s rDNA Miseq high-through sequencing technology, and the consequent bioinformatics analysis. Furthermore, the level of tight junction between intestinal epithelial cells will be analyzed as well. These investigation will lead us to find out the effects of abrupt temperature changes on intestinal microecology and the relationship between immune system and intestinal microecology. The results will provide us a better understanding of the alteration of Chinese soft-shelled turtle mucosal immune system after abrupt temperature changes, and guide its production in practice.

自然界爬行动物经常经历温差骤变的天气，这种胁迫对其肠道免疫及微生态系统究竟有着怎样的影响，尤其是在分子水平，目前尚未见有报道。中华鳖（Pelodiscus sinensis）作为爬行动物代表物种之一，是重要的水产经济物种。在养殖过程中，温差骤变胁迫常会造成其大量死亡，原因尚不清楚，但肠道免疫功能及微生态系统的变化很可能是重要原因之一。本研究拟利用最近公布的中华鳖基因组信息，在分子水平探讨温差骤变胁迫对中华鳖肠道组织免疫功能的影响；同时运用原核生物16s rDNA Miseq高通量测序技术，结合生物信息学分析方法，探讨温差骤变胁迫对中华鳖肠道微生物群落结构的影响；结合对肠道上皮细胞间紧密连接结构的检测，阐明温差骤变胁迫对中华鳖肠道微生态系统的影响，以及肠道免疫系统与微生态系统可能的内在联系。项目成果可为深入了解温差骤变胁迫对中华鳖免疫系统的影响提供基础数据，并为中华鳖养殖生产提供理论指导。

爬行动物代表中华鳖，是我国重要的水产经济物种，在养殖过程中经常遭受着温差骤变胁迫，大量死亡，本研究利用释放的中华鳖基因组序列信息及肠道细菌16s rDNA高通量测序技术，着重从中华鳖肠道免疫系统及肠道微生态系统在分子水平的的变化，研究了温差骤变胁迫对中华鳖的影响，阐述了死亡的可能机制。为了更准确对中华鳖肠道进行取样，我们采用形态学观察、组织切片及标记基因细致划分了中华鳖的肠道，意外发现，组织学上划分为结肠的部分，分子水平划分则属于小肠和大肠的过渡区段，有着小肠和大肠的混合特征。在此基础上，我们开展了免疫学研究和肠道微生态研究，研究结果及结论如下：① 温差骤变胁迫后，中华鳖的主要一些免疫分子在免疫应答中出现受急性低温胁迫的影响表现出“应答延迟”的现象，从而导致在胁迫后免疫应答早期，免疫能力降低。而恢复到养殖温度后，主要免疫分子在免疫应答中的表达恢复正常。② 温差骤变胁迫后，中华鳖肠道细菌结构发生改变。急性低温胁迫过程中，由于中华鳖会停止进食，肠道细菌在门及属水平均处于下降趋势，导致部分条件性病原菌成为肠道主要优势菌（本研究中，发现的了丰度较高的气单胞菌属，尤其是嗜水气单胞菌），该菌属于广温性条件下致病菌细菌，在较低温度下也能生长并感染宿主。此外，我们还开展了温差骤变胁迫后中华鳖肠道完整性研究，发现③急性冷胁迫对中华鳖肠道物理屏障在不同区段影响有差异，即急性冷胁迫对肠道黏膜上皮的形态没有明显影响，对回肠后段的杯状细胞数目、肠绒毛长度和肠壁厚度没有显著影响，但会降低中华鳖大肠肠壁厚度，增加复温组大肠的杯状细胞数目。同时，肠道的岩藻糖基化基因表达降低，急性冷胁迫后期回肠后段紧密连接水平降低、大肠紧密连接水平增加。