Tbx3调控小鼠胚胎期乳腺原基发生发育分子机制的研究

The transcriptional factor Tbx3 is necessary for the maintenance of embryonic stem cell self-renewal and organogenesis during embryonic development. Tbx3 regulates the formation of mammary anlagen. Haploinsufficiency of Tbx3 in human leads to the ulnar-mammary syndrome (UMS), which is characterized by severe inborn mammary hypoplasia, limb deficiencies and heart malformation. In mice, Tbx3 is one of the earliest markers of mammary epithelial cells in embryonic development. Tbx3 deleted mice have reduced ductal branching, and even fail to develop most mammary placodes all together. However, the mechanisms of Tbx3’s role in regulating mammary initiation and development are not very clear. In this study, we will search for genes downstream interacting with Tbx3 in mammary anlagen by micro ChIP-seq and RNA-seq, and test these genes’ fuctions on mammary activities via experiments in vitro and in vivo and through mice models, in order to explore the molecular mechanisms of Tbx3 regulation on embryonic mammary anlagen initation and development, hoping to provide theoretical references for illustrating the role of Tbx3 in mammary specialization and pluripotency maintenance and differentiation of mammary stem cells during normal development and its application in diagnosis and therapy for breast cancer or other diseases.

转录因子Tbx3对胚胎干细胞的自我更新和胚胎发育过程中包括乳腺在内各器官的发生起着至关重要的调控作用。人类Tbx3的单倍剂量不足即可导致尺骨-乳腺综合征（UMS），出现四肢、乳腺发育障碍和心脏畸形等先天性缺陷；而在小鼠上，Tbx3的诱导表达是乳腺特化形成的最早标志之一，Tbx3缺失会导致乳腺发育异常。然而，Tbx3调控乳腺发生发育的机制并不十分明了。本课题拟通过微量组织细胞染色质免疫共沉淀结合测序技术（micro ChIP-seq）和转录组分析即RNA测序技术（RNA-seq）等方法在乳腺发育早期即胚胎期乳腺原基中检测和分析与Tbx3互作的下游靶基因，并通过体内外实验和动物模型等方法来验证这些靶基因的功能，深入探讨Tbx3调控乳腺发生和发育的分子机制，为解析Tbx3在正常发育过程中对乳腺特化形成、乳腺干细胞多能性维持与分化所起的作用及其在乳腺癌等疾病诊断与治疗方面的应用提供理论借鉴。

乳腺是哺乳动物独有的特征，其主要功能是以乳蛋白和脂肪的形式为后代提供营养。此外，乳腺也被广泛地用作研究基本生物发育过程、干细胞以及癌症发生的器官模型。Tbx3是转录因子T-box家族的一员，在发育、肿瘤发生、细胞命运决定和组织稳态中发挥着重要作用。在小鼠上，Tbx3的表达是乳腺特化形成的最早标志之一，Tbx3缺失导致胚胎期乳腺发育异常。然而，Tbx3在乳腺发生发育过程中发挥的具体功能及相应机制并不十分明了。.本研究首先利用CRISPR/Cas9技术构建了Tbx3-C-GFP荧光报告小鼠，通过对GFP的跟踪观察发现在胚胎期乳腺的发生发育过程中，乳腺原基上皮细胞Tbx3的表达量先升高后降低。乳腺上皮条件性Tbx3敲除小鼠研究结果表明，Tbx3的缺失导致第2对儿乳腺原基无法形成，其余原基形成后因发育异常而退化消失。细胞凋亡和增殖检测结果显示，与对照组相比，Tbx3敲除后的乳腺原基细胞没有发生凋亡，细胞增殖信号异常升高。分析Tbx3敲除后乳腺原基的RNA-Seq结果发现，Tbx3敲除后乳腺原基上皮细胞的中心体异常变大，暗示其纺锤体未能正确组装，从而导致细胞阻滞在分裂期，发生了有丝分裂灾变。为了阐明Tbx3是如何对乳腺原基细胞有丝分裂进行调控的，本研究尝试对乳腺原基进行ChIP实验。由于实验条件不合适，乳腺原基细胞Tbx3 ChIP实验未能成功。参考已发表的Tbx3 ChIP-Seq数据，结合RNA-Seq结果发现与有丝分裂密切相关的中心体蛋白基因Nin被Tbx3直接结合并抑制。双荧光素酶报告系统实验进一步验证此结果。最后，本研究分析了已知与乳腺发育密切相关的基因的表达变化，结果表明，Tbx3敲除后，与乳腺腔细胞发育密切相关的基因表达量显著降低，暗示Tbx3对乳腺原基腔祖细胞发育及分化能力的维持十分重要。.综上，本研究对乳腺原基中Tbx3的表达变化、Tbx3条件性敲除后乳腺原基的发育表型以及相应的分子机制进行了探讨，发现Tbx3的表达对胚胎期乳腺的器官发生和发育必不可少。加深了人们对Tbx3在乳腺器官发生发育中的作用的认识，为进一步研究乳腺干细胞多能性的维持与分化和Tbx3在乳腺癌诊治中的应用等方面提供了理论参考。