希瓦氏菌电子传递途径改造实现微生物高效电合成研究

A great deal of reducing equivalents are required in biosynthesis of highly reduced compounds, however, the synthesis efficiency is restricted by the chemical carbon sources with limited electrons. Microbial electrosynthesis (MES) is a new method that enables microbes to obtain electrons and reducing power from cathodes. However, the current low efficiency of MES restricts its industrial applications. The method to increase the MES efficiency is to solve the essential problem of low efficiency of electrons' inward transfer to the microorganism and consumption rate by the microorganism. To this end, we propose to use novel synthetic biology methodologies to engineer Shewanella to promote the efficiency of inward electron transfer via constructing protein-scaffolds to position the reductases near the region of the inner membrane and engineering the electroactive biofilm; following by directing electrons to the target metabolic pathways to achieve the reduction of carbon dioxide and biosynthesis of Omega-3 polyunsaturated fatty acids. This proposal is to increase the efficiency of electrons' inward transfer and consumption via two ways simultaneously by engineering cells' membrane and metabolism, providing novel ideas in engineering microbes for MES. Meanwhile, the proposed research applies synthetic biology strategies into MES, expanding the research domain of synthetic biology.

高还原度化合物的微生物合成需要大量的还原力，但碳源所含的电子有限，限制了其合成效率。微生物电合成是一种提供还原力的新方法，可以将微生物从电极获取的电子转化为细胞的还原力。但是，目前微生物电合成效率较低，限制了其广泛应用。提高微生物电合成的效率要解决如何克服微生物细胞传入和利用电子效率低等核心问题。为此，本申请提出利用合成生物学方法改造微生物的新策略：即通过蛋白酶的空间骨架聚集技术实现还原酶在细胞内膜附近的局部聚集和定位，并构建电活性生物膜，来提高希瓦氏菌电子传入速率；同时将传入的电子导向目标代谢途径，通过将二氧化碳还原为Omega-3多不饱和脂肪酸加强电子利用速率。本项目从细胞膜内外双管齐下提高电子传入速率和利用效率，提出了微生物电合成改造的新思路；同时将合成生物学策略应用到微生物电合成研究，拓展了合成生物学的研究范畴。

微生物发酵是当前生化合成的研究热点，但细胞内还原力限制了微生物发酵所需碳源的成本。微生物电合成（MES），即利用微生物吸收外界提供的电子，将高度氧化的原料在微生物胞内还原为有商业价值的化学品。然而，目前微生物电合成最大的技术瓶颈是微生物的胞外电子传递效率较低，限制了其电合成的效率。为实现微生物高效电合成，本申请选用希瓦氏菌作为平台菌种进行合成生物学改造，研究提高其电子传入速率的有效方法：（1）利用合成生物学手段，促进电子从阴极到细胞传递并偶联入细胞代谢。（2）通过分子生物学改造，使希瓦氏菌形成更厚、活性更高的导电生物膜。（3）利用合成生物学技术，在希瓦氏菌内整合Wood-Ljungdahl二氧化碳固定路径和omega-3多不饱和脂肪酸合成路径。.本基金针对Shewanella胞外电子传递途径的增强和omega-3多不饱和脂肪酸的生物合成开展了一系列研究。一方面，通过在Shewanella内膜表达蛋白骨架固定消耗NAD(P)H的酶，在胞内过表达黄素（flavins）合成途径（来自Bacillus subtilis）提高自产电子穿梭体的水平，工程设计Shewanella胞内NADH/+ pool，促进电子的胞外传递并高效偶联入细胞代谢。一方面，优化ydeH的表达以及通过加入高导电的氧化石墨烯（GO）使Shewanella自组装成为高导电的3D生物膜，最终拉动Shewanella的电子传递速率。另一方面，利用无细胞体系研究了有氧途径和厌氧途径中的各个酶对omega-3多不饱和脂肪酸合成的影响以及酶之间的相互作用，由此指导omega-3多不饱和脂肪酸的胞内合成。同时，利用C3N4的光电转换能力与Rasltonian eutropha H16的H2、CO2转化能力，构建无机-生物杂化人工光合系统，实现CO2的固定，并进一步应用到合成omega-3多不饱和脂肪酸中。.本项目所选课题为近年来合成生物学领域的新兴研究热点，通过以上技术手段，在希瓦氏菌中构建一条高速电子传递通道，最终实现将高氧化态的廉价碳源（CO2）转化为高还原态的omega-3 不饱和脂肪酸。以omega-3 不饱和脂肪酸的合成为例，提出解决微生物高效电合成中的若干关键问题的方法，进而构建新型微生物电合成技术体系，为合成生物学和微生物电合成的学科交叉发展提供新的思路。