胶质细胞TSC基因缺失致结节性硬化病癫痫的机制及药物治疗

结节性硬化病（TSC）是由TSC1或TSC2基因突变所致的常染色体显性遗传病，常涉及多脏器系统。其中神经系统的损害尤其严重，包括癫痫、认知障碍和自闭症。虽然由TSC1或TSC2突变所致的TSC在临床表现上有许多相同之处，但大量证据表明TSC2较TSC1突变对神经系统的损害更严重。我们已成功建立选择性敲除胶质细胞TSC1基因的小鼠模型，表现出与临床相似的自发性癫痫、生存期缩短和脑体积增大。为了平行比较TSC2基因突变与TSC1基因突变在表型上的差异，以及寻找导致这些差异的可能分子机制，本项目拟采用相同的GFAP-Cre重组酶，建立选择性敲除胶质细胞TSC2基因的小鼠模型。并在此新模型上，进一步探讨mTOR信号通路上的抑制剂如雷帕霉素等对自发性癫痫和学习记忆的作用,寻找针对发病机制而不是症状的新型抗癫痫药物,为临床治疗开拓新思路。

本项目参照项目申请书，在Tsc2GFAPCKO小鼠进行了一系列实验，完成Tsc2GFAPCKO与Tsc1GFAPCKO小鼠癫痫发生频率及生存期、神经胶质细胞数目、尼氏染色、mTOR信号通路及GLT-1蛋白表达的比较以及雷帕霉素的治疗作用观察，发现Tsc2GFAPCKO小鼠的癫痫发作较Tsc1GFAPCKO早，且发作较频繁，且生存期较短；从第1周或第3周开始，Tsc2GFAPCKO小鼠海马或新皮层GFAP的数目即较Tsc1GFAPCKO小鼠显著增加；第5周开始，Tsc2GFAPCKO小鼠脑湿重较Tsc1GFAPCKO小鼠显著增加，两者从第3周开始，脑湿重均较对照组明显增加。对于海马CA1区细胞的紧致度观察发现，两CKO小鼠细胞均变得疏散，尤其以Tsc2GFAPCKO为重；从第1周开始，CKO小鼠p-S6的表达均较对照组增高，GLT-1的表达较对照组下降，且Tsc2GFAPCKO小鼠p-S6表达较Tsc1GFAPCKO更高但GLT-1表达无明显差异，提示mTOR信号通路的更加激活是导致Tsc2GFAPCKO小鼠相应表型改变严重的基础；在小鼠出生后2周开始给予3mg/kg雷帕霉素，能显著降低S6蛋白磷酸化水平，减少自发性癫痫的发生，并显著延长生存期、改善学习记忆障碍。在项目实时过程中，由于转基因小鼠正在进行保种和净化，没有产出能大批量用于实验的动物，且Roscovitine在体内使用暂无先例，故改在SD大鼠观察了PI3K抑制剂哌立福辛的作用。发现哌立福辛对KA致痫诱发的Akt磷酸化增加有抑制作用，且对KA致痫诱发的神经元死亡有保护作用，并能显著降低KA致痫诱发的自发性癫痫的发生。同时，我们还发现雷帕霉素给药后短期内对正常大鼠和KA致痫大鼠mTOR信号通路的矛盾性作用，雷帕霉素短期内给药对S6磷酸化有矛盾性增加作用，伴随着癫痫的持续时间延长，程度增高，并使神经元细胞死亡增多；其变化与上游蛋白变化一致。 . 以上研究已发表标注基金资助的SCI论文4篇和中文述评1篇，其中1篇IF为7.5，1篇为4.0。参加国内学术会议4人次，参加国际会议1人次，并邀请外国专家来访2人次。新增各级人才项目6人次。培养硕士生4名，其中1名成功转博。指导药学本科论文8人次，其中4名获浙江大学城市学院优秀论文，大大提高了本学科的科研氛围及在省内和国内癫痫研究中的地位。