靶向HBV核衣壳组装过程的药物筛选细胞模型

Capsid assembly is an attractive target for the development of new anti-HBV drugs. An obstacle in the screening of compounds targeting HBV capsid assembly is the lack of convenient and efficient cell models. As a response to this urgent need in the development of anti-capsid drugs, we aim to construct a series of high-throughput cell models for compound screening, including (1) a cell model can be used to screen compounds targeting the formation of core dimer; (2) a cell model reflecting the formation of polymers of core dimers; and (3) a cell model that support a fast detection of the formation of capsid. These cell models will be designed to indicate two types of interactions during the formation of the capsid, i.e. the interaction between two core monomers and that between two core dimers. Engineering modification of the core protein will be conducted with the split luciferases or the infrared fluorescent proteins to construct these cell models. By using these 3 models, we will next perform a screening campaign against several libraries containing over thousands of compounds, to obtain new candidates with anti-HBV activity.

作为HBV关键组分的核衣壳，是开发新型抗HBV药物一种理想的抗病毒靶点。然而，靶向HBV核衣壳的药物筛选，面临缺乏简便、有效的细胞模型这一障碍，构建该类模型已成为迫切需要。本课题将围绕开发新型抗HBV药物这一目标，着力于构建靶向HBV核衣壳组装过程的一套高通量药物筛选细胞模型，即（1）靶向核心蛋白二聚体形成的药物筛选模型；（2）靶向核心蛋白二聚体多聚化过程的药物筛选模型；（3）靶向HBV核衣壳构型变化的药物筛选模型。这三种模型将基于核心蛋白的基因工程改造，结合分段荧光素酶互补技术或红外荧光蛋白标记策略，来表征影响核衣壳组装过程的两类相互作用，即核心蛋白二聚体内的相互作用和二聚体间的相互作用。预期这些模型不但可以精确表征核衣壳组装环节的关键事件，同时尽可能地保留病毒复制微环境。然后，我们将利用这三种细胞模型，对数千种化合物进行中小规模筛选，希望获得具有潜在开发价值的新型候选化合物。

慢性乙型肝炎仍然是严重影响我国人民健康的公共卫生问题。目前，用于乙肝治疗的药物包括核苷（酸）类似物和长效α干扰素，但这两类还远不足以彻底解决乙肝问题。因此，开发新型抗HBV药物已成为目前乙肝研究领域的当务之急。本项目以HBV核心蛋白组装过程为靶点，通过构建针对HBc二聚体形成和核衣壳形成的药物筛选细胞模型，进而筛选抗HBV新分子。本项目研究取得的主要结果及其意义如下：（1）通过在HBc蛋白的N端引入长的柔性接头，解决了外源蛋白与HBc融合时的结构和功能互相干扰问题，最大限度地保留了HBc重组融合蛋白的功能，为HBc的基因工程改造提供了新的重组位点与重组方式；（2）通过筛选4类分段荧光素酶，获得了可以快速表征HBc二聚体形成的新方法；（3）基于分段Rluc，成功构建了表征HBc二聚体形成的稳定表达细胞系SRC-HBc6；（4）利用SRC-HBc6，经过多轮筛选多个化合物库，最终获得了3种抗HBV新分子Arbidol, 20-脱氧巨大戟二萜醇和苯丁酸氮芥，并证明三者均通过影响核衣壳形成来抑制HBV复制，其中，20-脱氧巨大戟二萜醇具有较为独特的机制，在促进capsid形成的同时抑制HBV DNA；（5）成功构建用于抗HBV药物筛选的新型快速核衣壳检测系统，该系统利用红外荧光蛋白RFP709表征capsid形成，具有方便快捷的特点；（6）成功构建了一种基于真核细胞表面展示的多肽筛选系统，并基于该系统，筛选基于preS1 1-21aa的随机多肽库，获得了一种NTCP高亲和多肽，具有较好的抑制HBV感染活性；（7）成功构建了一种基于TurboID的新型邻近标记方法，并将该方法用于鉴定HBV核心启动子互作因子；（8）鉴定到一种新的HBV核心启动子转录正向调控因子STAU1，并发现STAU1通过与TARDBP相互作用，招募转录复合物HAT，从而促进HBV转录复制；同时，还发现STAU1通过与HBx相互作用，增加其稳定性，从而促进HBV转录复制。以上述研究结果为基础，发表SCI论文6篇，CSCD论文2篇，获得中国发明专利授权4项，圆满完成项目的预定研究任务，并为后续研究奠定了良好基础。