单细胞精度解析特发性男性不育症致病机制的研究

Infertility affects over 15% childbearing couples around the world and 60% of infertile males are idiopathic. Previous reports based on GWAS and TWAS showed the limits on variation in different population and clearly mechanisms were largely unknown. In our previous study, we identified altered gene expression patterns in testicular somatic cells of one NOA patient via scRNA-seq analysis, indicating scRNA-seq as a new approach for precise diagnosis and mechanism dissection in male infertility. In this study, we will extend to perform scRNA-seq on testicular cells of idiopathic fertile men from families, and further characterize the arrest stages and diagnostic differential profile compared with fertile men. At last, we will functionally validate the candidate disease-causing genes based on diagnostic profile via mouse model engineered by CRISPR-Cas9 and embryonic stem cell meiosis-in-vitro. This study will provide insights into the precise diagnosis and personal treatment in idiopathic male infertility.

不孕不育症困扰着全球超过15%的育龄夫妇，其中60%的男性不育患者为特发性不育症。以往基于基因组和转录组的关联分析存在难以在不同人群中重复、致病位点的机制解析不明确等不足。申请人在前期的研究中利用单细胞转录组测序技术对一例非梗阻性无精症患者的睾丸细胞进行研究，发现了患者睾丸体细胞中的转录本改变，建立了单细胞精度的无精症分子诊断平台。本研究将进一步运用该技术对特发性男性不育症发生机制进行解析，延伸单细胞转录组测序技术在不同类型的男性不育症中的诊断性应用。本研究将选取家系特发性不育症患者的睾丸细胞进行单细胞转录组测序，通过与可育男性睾丸单细胞转录组数据进行比较，发现特发性不育症患者睾丸细胞发育阻滞阶段，获得疾病特异的差异表达谱。结合CRISPR-Cas9基因编辑与胚胎干细胞体外精子发生技术，从动物和细胞水平模拟致病基因的作用机制，为最终实现男性不育症的高精度诊断和个性化治疗提供研究基础。

不孕不育症困扰着全球超过15%的育龄夫妇，其中60%的男性不育患者为特发性不育症。以往基于基因组和转录组的关联分析存在难以在不同人群中重复、致病位点的机制解析不明确等不足。本项目通过单细胞测序技术，对人鼠保守的精子发生关键通路及阶段特征性调控因子进行联合分析，探究男性不育症的致病机理和临床上男性不育的分子病因诊断靶点新型治疗手段。. 本项目通过可育与特发性男性不育患者的单细胞表达谱分析对人类精子发生过程中的自噬相关基因动态变化特征进行了整体描绘，验证出Cst3作为自噬的负性调控因子，其异常表达影响精原干细胞自我更新和生精能力，不育症患者睾丸细胞的转录组分析也进一步证实自噬稳态失衡与精子发生障碍和不育症之间高度相关，表明自噬异常基因集可能作为不育症的潜在致病靶点；同时对小鼠原始生殖细胞及出生后雄性生殖细胞的单细胞表达谱数据进行分析，填补了同平台下胚胎期小鼠精子发生中细胞命运转变过程和调控机制研究的空白，证明了胚胎期生殖细胞的身份转变对于雄性生育力的维持至关重要，鉴定出人－鼠生殖细胞保守性的调控因子；不育症治疗的基础研究方面，部分不育症患者缺乏成熟精子，仅有圆形精子可用于卵胞浆注射获得真正遗传学的后代，然而该技术面临妊娠率低、流产率高的应用瓶颈，为突破这一技术难题，我们利用单细胞多组学测序技术，阐明了小鼠ROSI胚胎的发育障碍的分子机制，尤其是原核阶段的表观遗传重编程缺陷，并进一步利用组蛋白甲基转移酶G9A的小分子抑制剂A366显著提高了ROSI胚胎的囊胚发育率和活产率。. 至此，本研究构建了胚胎期和成体生殖发育的单细胞转录组图谱，深入解析了影响精子发生的自噬、转录因子和表观调控网络，发现了多个不育症的潜在候选靶点，为生殖细胞发育及其障碍的机制解析及男性不育症的临床治疗提供了重要参考。