Dectin-1受体表达及其介导的磷脂酶D激活在肺上皮细胞应对烟曲霉侵染过程中的功能研究

肺上皮细胞"吞噬"重要病原真菌烟曲霉的孢子并释放炎症因子，是机体早期重要天然免疫反应，但其调控机制仍不清楚。Dectin-1是非TLR类模式识别受体，通常被认为只在巨噬、中性粒等髓样细胞中表达，可识别真菌细胞壁主要成份beta-1,3-葡聚糖介导天然免疫反应。我们已证实烟曲霉孢子内化侵入上皮细胞以及激活胞内重要信号蛋白-磷脂酶D，不仅可被dectin-1抗体阻断，而且与beta-1,3-葡聚糖密切相关。最新研究发现dectin-1可能在上皮细胞中表达，但表达规律及功能尚不清楚。本项目拟深入研究dectin-1在肺上皮细胞中表达规律，解析其介导的磷脂酶D信号通路，着力阐明该受体及其激活磷脂酶D对烟曲霉侵染上皮细胞和细胞炎症因子释放的调控机制。这将拓展人们对dectin-1受体功能和磷脂代谢信号机制的认识，对进一步揭示烟曲霉感染机理以及肺上皮细胞在抗感染天然免疫机制的作用具有重要意义。

上皮细胞是人体抵御病原微生物入侵的第一道屏障，在天然免疫反应中发挥着重要作用。烟曲霉是一类广泛存在于自然界的常见真菌，其分生孢子易被吸入肺泡中诱发肺上皮细胞肌动蛋白骨架重排从而内化侵入细胞进而引发一系列天然免疫应答，目前这些应答的具体分子调控机制仍不清楚。Dectin-1是细胞膜表面的重要受体，能够特异识别真菌细胞壁的主要成分β-1，3-葡聚糖，已有研究表明，dectin-1除了在单核、巨噬、中性粒细胞等髓样细胞中表达外，上皮细胞也极有可能存在着dectin-1的表达。本项目中我们发现dectin-1在肺上皮细胞中的表达不受烟曲霉感染的影响，可能与其他上皮细胞不同；封闭dectin-1可抑制烟曲霉内化侵入和上皮细胞内的PLD激活；而且烟曲霉休眠孢子在感染的初期就可诱发MCP-1和IL-8的释放增高，这可能与孢子萌发暴露β-1，3-葡聚糖无关；dectin-1或CR3受体能通过调理和不调理两种方式介导烟曲霉膨胀孢子诱导A549细胞分泌IL-8和MCP-1，但调理方式更加显著且两种受体没有协同作用。另外，在烟曲霉休眠孢子侵入A549细胞时，促炎因子IL-1β、IL-17A、IL-23等含量都有显著升高趋势，其中IL-17A更为明显，而抗炎因子IL-10在8h时间点的分泌量有下降趋势。再者，dectin-1受体可介导烟曲霉膨胀孢子诱导上皮细胞内PA（PLD催化产物）含量的增加，这可能也与烟曲霉表面色素有关；而烟曲霉重要毒素glitoxin可促进烟曲霉内化侵入肺上皮细胞，却抑制J774巨噬细胞吞噬烟曲霉孢子。最后，我们还发现烟曲霉感染可引起肺上皮细胞内多个与炎症及免疫反应、趋化性、JAK-STAT和MAPK等信号途径相关的基因显著上调；同时基于烟曲霉annexin基因建立了快速灵敏的烟曲霉感染LAMP检测技术并临床验证有效；更多，建立了大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ）原代分离培养技术平台为深入研究肺上皮细胞天然免疫现象奠定基础。综上所述，在前期工作基础上本项目继续探索了dectin-1在肺上皮细胞中的表达规律及其介导PLD活性的变化规律，探讨了 dectin-1在烟曲霉内化侵入肺上皮细胞及诱导炎症因子释放过程中的功能。这些工作加深了人们对烟曲霉致病及宿主天然免疫应答分子机制的理解，为防控和治疗烟曲霉感染提供了可靠的理论基础。