基于非天然氨基酸定点突变的曲妥珠单抗介导的抗体药物偶联物研究

Antibody Drug Conjugates (ADC) is new type of targeted drug that consists of an antibody, a potent cytotoxic drug, and a linker that attaches the two. Upon binding of the antibody to the targeted tumor antigen and internalization of the complex into the cancer cell, the drug is then released and kills the cancer cell. Unlike the previous heterogenous ADC, which directly used lysine or cysteine of the antibody to attach cytotoxic small molecular, in this study, we plan to introduce azide-containing unnatural amino acids (Nε-2-azide ethoxycarbonyl-L-lysine, NAEK) tag into the specific site of trastuzumab by site-specific mutagenesis, and introduce non-cleavable alky linker into the potent cytotoxic natural product triptolide and maytansine by chemical modification. Then take advantage of the mild azide-alky click reaction to prepare non-cleavable, site-specific and homogenous antibody drug conjugate to overcome the poor stability, poor safety and poor therapeutic index of previous heterogenous ADC.

抗体药物偶联物（ADC）是由单克隆抗体、细胞毒小分子和链接三部分共同构筑而成的一类新颖的靶向治疗药物，该类药物利用单抗对肿瘤表面相关抗原的特异性识别结合能力，将细胞毒小分子输送到肿瘤细胞，降低药物用量和对循环系统及机体其他部位的毒性，实现靶向治疗。不同于早期直接借助于单抗上的赖氨酸或半胱氨酸与细胞毒小分子进行的非定位偶联，我们拟通过定点突变技术在曲妥珠单抗上引入含有叠氮的非天然氨基酸（Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸，NAEK)，然后选择强效抗肿瘤活性物质雷公藤内酯醇和美登素作为细胞毒小分子，经过合理的结构修饰引入非裂解型炔基片段，借助反应条件温和的叠氮与炔烃的click反应来制备非裂解型、链接位点特异性、链接数目均一性的偶联物，以此来解决以往ADC类抗肿瘤药物研发过程中所出现的链接位点、链接数目的不均一性、稳定性差，治疗指数差的问题.

通过该项目我们探索了利用非天然氨基酸定点突变技术对曲妥珠单抗进行含有叠氮的非天然氨基酸定点标记，然后再通过反应条件温和的叠氮和炔烃的click反应来偶联细胞毒小分子来制备细胞毒小分子链接位点确定、数目均一的非裂解型抗体药物偶联物（ADC）。首先我们利用计算机模拟合理的的设计曲妥珠单抗上的可能突变位点，然后通过表达相应的抗体，成功的得到了曲妥珠单抗重链S141位点NAEK突变的含有叠氮的抗体HM1，这不仅为我们为后续的偶联工作奠定了基础也为其他相关抗体非天然氨基酸突变的设计提供了思路；其次，通过系统的分析雷公藤内之醇和美登素的构效关系我们合成和优化出了体外均有较高活性的含有非裂解型链接的炔基雷公藤内之醇衍生物和炔基美登素衍生物。这些衍生物不仅可以用于HM1的偶联，同时也可用于其他类型的含叠氮的抗体的偶联研究；再者，我们借助反应条件温和的炔烃和叠氮的click反应，得到了相应的抗体细胞毒小分子偶联物ADC-TL4和ADC-M3，体外细胞毒活性评价显示，他们均可以靶向的杀伤Her 2阳性的肿瘤细胞。进一步的体内抗肿瘤活性评价显示，ADC-M3虽然可以抑制Her 2阳性移植瘤生长，但是与文献报道的相关ADC，如TDM1相比有效剂量偏高，我们推测可能是由于HM1仅有两个非天然氨基酸（NAEK），造成最终的细胞毒小分子抗体比率（DAR）为2，而TDM1的DAR为3.6。这不仅提示我们在后续的该类抗体药物偶联物的设计中要尽量的提高DAR值，例如通过增加突变位点或设计可以携带双细胞毒小分子的链接系统，同时也为开展同类工作的同行提供了参考；最后，HM1偶联物具有较好的Her 2靶向性提示我们HM1在制备偶联位点专一性，偶联数目均一的Her2体内示踪剂的潜在价值（与相应的含炔基的放射性同位素或远红外探针分子）。