灰绿藜盐响应碱性螺旋环螺旋转录因子的调控机制及抗逆功能研究

Basic helix-loop-helix(bHLH) protein is an important transcription factor (TF) in regulation of gene expression of plant development and stress tolerance . In previous work, we revealed a bHLH TF-Cg bHLH001 in halophyte Chenopodium glaucum, which shared relatively higher homology to Arabidopsis XII bHLH TF, and was involved in functions of plant development and stress responses. However, distinct differences in the sequence and protein domain exist between Cg bHLH001 and the members of XII TF subfamily, and the regulation mechanism of XII TF subfamily in stress tolerance remains largely unclear. Based on this, in the present study, we employed Cg bHLH001 TF as material, try to analyze the expression patterns of Cg bHLH001 TF in plant development and stress responses by quantitative RT-PCR and Western blot; to identify the N-terminal and C-terminal key functional domains for protein interaction and/or transcriptional activation by truncated fragments; meanwhile, to determine the DNA binding sequence of Cg bHLH001 TF in vivo by chromatin immuno-precipitation (ChIP) and high throughput sequencing (seq); finally, to analyze the stress tolerance function of Cg bHLH001 TF and its regulation of the downstream genes. By fulfilling the above targets, we try to clarify the regulation mechanisms of Cg bHLH001 and its function in stress tolerance, which reveals a molecular basis pattern as “structure-regulation-function”, and can also provide scientific evidence for molecular breeding in development of stress tolerance crops.

碱性螺旋环螺旋（bHLH）蛋白是一类调控植物发育及抗逆基因表达的重要转录因子。前期我们从盐生植物灰绿藜中发现了一个bHLH转录因子-Cg bHLH001，与拟南芥bHLH因子的XII亚族关系最近，涉及发育、逆境响应等功能。然而Cg bHLH001在序列和结构上与XII亚族成员存在明显差异，且XII亚族在植物抗逆中的调控机制报道十分有限。基于此，本研究以灰绿藜Cg bHLH001转录因子为材料，拟通过qPCR和免疫印迹法分析其发育及胁迫表达模式；通过构建N端和C端系列缺失片段克隆确定蛋白互作和转录激活功能域；同时通过染色质免疫共沉淀及大规模测序手段鉴定转录因子在植物体内结合的DNA位点信息；最后通过转基因及转录组数据分析Cg bHLH001下游调控基因及其抗逆功能。通过上述结果，阐明灰绿藜bHLH转录因子的调控机制及抗逆功能，揭示“结构-调控-功能”的分子基础，为抗逆分子育种提供科学依据。

前期我们从盐生植物灰绿藜中发现了一个bHLH转录因子-CgbHLH001，其在植物抗逆中的调控机制报道十分有限。基于此，我们通过对其表达模式、与CDPK互作及功能结构域分析、在植物体内结合的DNA位点及下游基因调控网络解析等方面阐明其抗逆功能。基于项目设定的目标，我们取得了如下进展：（1）验证了灰绿藜转录因子CgbHLH001与激酶CgCDPK的互作关系及其磷酸化的互作实质。（2）揭示了N端和bHLH域对CgbHLH001的核定位作用；突变分析显示其N端第96位丝氨酸的磷酸化对CgCDPK与CgbHLH001的互作有重要意义。（3）阐明了CgbHLH001基因在灰绿藜中的表达模式，成株期表达量显著高于苗期和花期；叶中表达量高于根和茎；积极响应盐、旱、ABA、低温等非生物胁迫，并随胁迫表达量显著升高。（4）通过转基因烟草解析了CgbHLH001的抗逆功能，CgbHLH001作为正调控因子，通过激活抗氧化剂、抗氧化酶以及相关基因的表达从而清除ROS的伤害并发挥抗逆功能。（5）通过全蛋白纯化和免疫方法完成了CgbHLH001蛋白的单克隆抗体制备，正在进行染色质免疫共沉淀实验及后续的富集DNA和测序工作。（6）已获得35S::CgbHLH001及PCgbHLH001:: CgbHLH001的拟南芥转基因株系并验证了该基因的抗逆功能，已送公司进行转录组测序分析。（7）获得了CgbHLH001基因上游1 533 bp的启动子序列并分析了活性，发现5’-UTR区对启动子活性具有显著增强作用。（8）获得了CgbHLH001启动子结合的三个转录因子：CgWRKY51、CgMYB1、CgMYB3R，并验证了其结合关系，同时分析了表达模式。（9）已发表SCI收录论文2篇，中文核心期刊论文2篇；培养博硕士研究生5人；建立国内合作1项；利用CgbHLH001基因正在转化玉米研究1项。