东亚飞蝗Serpin调控Toll信号通路和PPO信号系统抵抗真菌感染的机制研究

Negative regulating factor Serpin can inhibit the further activation of the Toll pathway and prophenoloxidase system in insects. Therefore Serpin will become the cadidate target for insecticidal microbial pesticides. Previous research showed the Toll pathway and prophenoloxidase system were activatied properly through the fungal infection. Further investigation showed there were at least 7 different Serpins in Locusta migratoria manilensis. But which Serpin or Serpins involved in regulating the activation of the Toll pathway and prophenoloxidase cascade properly are still unclear. In our proposal,the full length cDNA of 7 serpin genes will be cloned by using the Locusta migratoria manilensis infected with Metarhizium acridum. The spatial expression of serpin in locust and the dynamic expression of serpin after fungal infection will be tested by real time RT-PCR. The change of the activation of the Toll pathway and prophenoloxidase sysytem will be investigated by multigene expression profiles and enzymatic activity when serpin gene is interfered by RNAi.The suvival rate of the locust will be tested during the fungal infection.The key Serpin which regulates the activation of the Toll pathway and prophenoloxidase system will be found finnally. The results revealed in our proposal would provide detail mechanism for the activation strategy in locust and may help to consider Serpin as an effective targets for pesticide.

负性调控因子Serpin蛋白因可抑制昆虫体内Toll通路和酚氧化酶（PPO）系统进一步激活，有望成为杀虫微生物农药候选靶标。重大农业害虫东亚飞蝗体内存在七种Serpin, 前期证实：真菌感染时东亚飞蝗体内Toll通路和PPO系统活化可能受到Serpin调控，但究竟哪种Serpin参与此过程及具体机制尚不清楚。本项目以东亚飞蝗及其病原真菌绿僵菌为材料，通过基因克隆获得东亚飞蝗体内7个serpin基因全长，利用定量PCR确定其组织分布和真菌感染时动态转录变化；采用RNAi结合多基因表达谱分析和酶活测定，分析Serpin异常对Toll通路和PPO系统的影响；生测分析Serpin异常对东亚飞蝗存活率及抵抗真菌能力的影响，从而最终确定东亚飞蝗体内调控Toll通路和PPO系统的关键Serpin。本项目不仅将阐明Serpin调控东亚飞蝗体内免疫反应的详细机制，还将为杀蝗真菌分子育种提供新靶点及理论依据。

负性调控因子Serpin蛋白因可抑制昆虫体内Toll通路和酚氧化酶（PPO）系统进一步激活，有望成为杀虫微生物农药候选靶标。重大农业害虫东亚飞蝗体内存在七种Serpin, 前期证实：真菌感染时东亚飞蝗体内Toll通路和PPO系统活化可能受到Serpin调控，但究竟哪种Serpin参与此过程及具体机制尚不清楚。本项目以东亚飞蝗及其病原真菌绿僵菌为材料，通过研究，克隆获得了东亚飞蝗体内5个serpin基因全长cDNA及2个serpin基因片段。用RT-PCR的方法检测了7个serpin的组织定位情况，发现7个基因在不同组织（脂肪体、血细胞、中肠、体壁）的表达情况各不相同，其中serpin2在中肠的表达最高，serpin3在血细胞中的表达最高，serpin5在脂肪体中的表达最高，提示这个3个基因可能与东亚飞蝗的免疫反应有关。用定量PCR的方法检测真菌感染后serpin2/serpin3/serpin5的表达情况，发现serpin3表达呈明显增加趋势，提示serpin3可能与参与宿主机体抵抗真菌。合成制备了serpin3的双链RNA（dsRNA），检测发现，该dsRNA可部分降低serpin3 mRNA水平。真菌绿僵菌感染东亚飞蝗后，向东亚飞蝗体内注射serpin3-dsRNA，结果显示Toll信号通路相关基因持续活化，且东亚飞蝗黑化反应有增强。真菌绿僵菌感染后，向东亚飞蝗体内注射serpin3-dsRNA，初步生测研究结果显示，东亚飞蝗个体的生存率及抵抗真菌能力下降。以上研究提示，东亚飞蝗体内serpin3可能为调控Toll信号通路和PPO信号系统抵抗真菌感染的关键负性调控基因，这为阐明Serpin3调控东亚飞蝗体内免疫反应的详细机制和杀蝗真菌分子育种提供了可能的新靶点及理论依据。本项目还新增了部分研究内容：克隆了4个Toll信号通路基因的全长，分别为spatzael、tube、myd88和cactus；同时新增分析了在绿僵菌感染东亚飞蝗的早期，绿僵菌中的何种物质引起了东亚飞蝗体内的免疫反应，研究结果发现：感染早期，绿僵菌细胞壁上β-1,3-葡聚糖经东亚飞蝗体内Toll信号引起其体内的固有免疫应答反应。该发现为进一步深入探讨真菌与直翅目昆虫间的免疫互作机制提供了新的线索。