tRNA片段—非编码小RNA基因调控网络对脑卒中后血管新生的影响及其机制研究

The recovery of blood supply as soon as possible is the key point for the treatment of ischemic stroke. Understanding of the molecular mechanism of post-ischemic angiogenesis comprehensively is the most important prerequisite for promoting therapeutic angiogenesis. The latest studies indicated that the tRNA-deriverd fragments (tRFs) participated in diverse gene regulation system and are widely involved in a series of pathophysiological processes. Our preliminary study showed that the expression of tRFs-derived from tRNAVal and tRNAGly were strikingly up-regulated in the rat brain 24 hours after ischemia induction as determined by deep sequencing and bioinformatics analysis. Overexpression of these tRFs significantly inhibited endothelial cell proliferation, migration and tube formation. The expression of Dicer was significantly reduced in response to the up-regulation of the tRFs. Combined with previous reports that tRFs regulated the expression of target genes by binding to the RNA binding protein YBX1, we hypothesized tRFs, Dicer and microRNAs work as a new gene regulatory networks and participate in regulation of the post-stroke angiogenesis. In this project, we will investigate the function of tRFs-Dicer-miRNA network in angiogenesis and clarify the molecular mechanism by which tRFs regulates post-ischemic angiogenesis.

缺血性脑卒中治疗的关键是尽快恢复缺血区的血供，全面理解脑卒中后血管新生调控机制是研发高效促进治疗性血管新生技术的关键前提。最新研究发现由tRNA特异性剪切而来的tRNA片段（tRFs）具有强大的基因调控功能。我们在前期研究中对脑卒中大鼠脑组织进行了深度测序分析，发现脑缺血后tRNA-Val和 tRNA-Gly来源为主的tRFs丰度明显增加；实验还表明这类tRFs可显著抑制内皮细胞的增殖、迁移及成管能力，同时伴有Dicer酶表达显著下调。结合我们前期研究结果, 我们推测存在一条以tRFs、Dicer和miRNAs等非编码小RNA构成的新的基因调控网络并参与了脑卒中后血管新生的调控。本项目拟深入探讨tRFs、Dicer及其miRNAs等在血管新生过程的变化规律及相互调控关系，明确tRFs等小RNA基因表达调控网络对血管新生的影响和作用途径，进一步阐明脑卒中后血管新生的分子调控机制。

血管再生有助于改善缺血性脑卒中后的血流供应，是加速卒中后神经功能恢复的一种关键机制。tRNA特异性剪切而来的片段（tRFs）是一类经过精细调控剪切产生、具有特定生物活性的非编码小RNA，其在脑缺血后的作用尚不清楚。我们通过对缺血性脑卒中模型大鼠脑组织测序分析发现，tRFs在卒中后出现了明显的升高，其中tRNA-Gly和tRNA-Val丰度最高。探究其生物学意义，我们通过体内下肢缺血模型及体外内皮细胞缺血缺氧模型中进一步论证tRNA-gly和tRNA-Val具有负向调控血管再生的作用。机制上，我们通过基因编程技术及测序分析发现tRNA-Gly和tRNA-Val通过KDM5B/KDM6A-Dicer轴负调控了血管生成基因，从而抑制脑缺血后血管再生。该研究系首次发现脑缺血后tRNA-Gly和tRNA-Val对血管生成的调控作用，有助于全面深入了解脑缺血后血管生成的调控网络。基于tRNA-Gly和tRNA-Val在负调控血管生成中的作用，一个同样和血管生成有着密切关系的疾病——脑肿瘤，引起了我们的注意。脑胶质瘤目前治疗手段有限，预后差。抑制肿瘤的血管形成可以减缓肿瘤进展，改善患者预后。tRNA-Gly和tRNA-Val对于血管生成的负调控功能强烈提示其对脑胶质瘤的治疗作用。我们发现tRNA-Val和tRNA-Gly能够明显抑制肿瘤生长，肿瘤细胞的增殖和血管形成。进一步通过tRNA模拟物上调U87和U251细胞中tRNA-Val和tRNA-Gly的表达水平，结果显示肿瘤细胞的增殖水平和侵袭能力受到了明显的抑制。另外，利用上调tRNA-Gly的U87细胞培养基和内皮细胞共培养，我们发现其导致内皮细胞增殖、侵袭和微管形成能力降低。机制上，我们对转染了tRNA-Gly和tRNA-nc的U87细胞进行全基因转录组测序，在差异表达基因(DEGs)中鉴定出6个共表达基因簇。高相关模块的功能富集分析显示，细胞周期和细胞增殖相关基因表达明显改变。此外，基因集富集分析表明DEGs与血管生成相关。16个促血管生成基因表达量降低，6个抗血管生成基因表达量升高，提示tRNA-Gly可调控胶质瘤细胞中血管生成相关基因。综上所述，我们的研究结果表明tRNA可能抑制脑胶质瘤的生长，且这种作用是通过抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤触发的血管生成来介导的，这表明tRNA在治疗胶质母细胞瘤方面具有良好的治疗潜力。