基于代谢组学及高通量测序技术筛选远志差异活性成分与皂苷合成关键酶基因

远志，是我国重要的大宗药材之一，用量非常大；而阐明优质远志药材种质资源的整体化学表型，明确远志优势产区，是保证其中医临床疗效及科学可持续发展的基础。本项目针对远志种质资源一直存在的争议问题，拟选用商品药材主产区与非主产区3年生远志药材为研究对象，通过代谢组学技术找出不同产地远志的差异代谢物活性成分，明确不同产地药材间是否存在着显著性差异；采用第二代Solexa高通量测序技术对远志进行转录组及基因表达谱研究，明确不同产地样品间基因表达谱的差异，找出远志主要活性成分-皂苷类生物合成所涉及的所有基因及关键酶基因，探明不同产地远志皂苷生物合成关键酶基因的表达水平及表达模式，从分子机理水平阐释不同产地对远志质量的影响，明确优质远志药材的整体化学表型及优势产区，为远志规范化种植的生产实践提供直接的实验数据，也为远志中主要活性成分含量的提高及基因调控提供新的研究思路与方法。

本项目首先针对远志三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因进行了研究。通过UPLC对不同部位、不同生长年限、不同产地的远志进行指纹图谱研究，最后确定以不同部位（根、茎叶、种子）及不同发育时期（4月龄→16月龄）的远志药材为研究对象。其次，通过转录组及基因表达谱测序发现一系列差异表达的酶基因，同时采用qRT-PCR技术结合UPLC/Q-TOF MS代谢组学技术，对远志皂苷生物合成途径中的关键酶进行了挖掘与验证。结果表明：在远志三萜皂苷生物合成的上游途径，即皂苷前体物质的合成中，甲羟戊酸（MVA）途径占主导地位；在三萜皂苷的碳骨架合成途径（C5→C30）中，鲨烯合成酶（SQS）、鲨烯环氧酶（SQE）和β-香树脂合成酶（β-AS）与三萜皂苷的含量呈正相关性，而环阿齐醇合成酶（CAS）则呈负相关性。. 同时,本项目还对不同来源远志中的差异化学成分进行了系列研究。采用UPLC/Q-TOF MS及NMR代谢组学技术对不同来源（不同部位、不同生长年限、不同发育时期、不同品种）远志间的化学成分进行表征，并进而寻找差异成分。结果表明：（1）不同部位（根与筒）：根与筒的差异主要在3,6-二芥子酰基蔗糖的含量；（2）不同生长年限（1年生、2年生、3年生）：皂苷类成分的含量随着生长年限增加，而口山酮及部分低聚糖酯的含量则减少；（3）不同发育时期（4月龄→16月龄）：远志中皂苷类、蔗糖类、低聚糖类、口山酮类在12月至次年3月含量较低，4-7月含量逐渐升高，9月份以后含量逐渐降低；（4）不同品种（晋远1号与晋远2号）：不同品种之间的差异主要在低聚糖及蔗糖酯类化合物的含量，而皂苷类和口山酮类的差异不明显。此外，本项目还对远志药材“消肿”功效及其化学物质基础进行了初步研究，为下一步以远志药材为研究对象进行活血化瘀药物的开发奠定了一定的基础。