建立一种研究血液中肝细胞肝癌复发转移相关蛋白标志物的新体系

肝细胞性肝癌占原发性肝恶性肿瘤90%，转移和复发是影响其生存率的主要因素。但目前临床上缺乏可以预测肝癌转移和复发的标志物。本研究首先对肝癌新鲜组织进行原代培养，采用高分辨率质谱分析条件培养基总蛋白的方法，建立肝癌相关蛋白质数据库并进行生物信息学分析；结合目前已发表的肝癌转移、复发相关基因表达谱及蛋白质数据库，选定候选肝癌复发转移标志蛋白；通过大样本（血浆和组织标本）的回顾性验证筛选出对转移、复发、预后更具显著影响蛋白标志物，并建立联合检测模型，为肝癌病人术后治疗措施提供科学依据，预测及检测复发转移，给予积极适当治疗。

背景：肝细胞性肝癌占原发性肝恶性肿瘤90%，转移和复发是影响其生存率的主要因素。但目前临床上缺乏可以预测肝癌转移和复发的标志物。主要研究内容：本研究首先对肝癌新鲜组织进行原代培养，采用高分辨率质谱分析条件培养基总蛋白的方法，建立肝癌相关蛋白质数据库并进行生物信息学分析；结合目前已发表的肝癌转移、复发相关基因表达谱及蛋白质数据库，选定候选肝癌复发转移标志蛋白；通过大样本（血浆和组织标本）的回顾性验证筛选出对转移、复发、预后更具显著影响蛋白标志物，并建立联合检测模型，为肝癌病人术后治疗措施提供科学依据，预测及检测复发转移，给予积极适当治疗。结果：通过对6例伴有HBV感染的HCC癌组织及其对应的癌旁非肿瘤组织进行体外无血清培养，收集其无血清条件培养基（Conditioned medium，CM），经一维SDS-PAGE分离后，采用LC-MS/MS质谱鉴定条件培养基中的蛋白质。通过质谱分析HCC条件培养基共鉴定出1365个蛋白，建立了HCC分泌/释放蛋白质数据库。GO分析表明，其中定位于细胞外和细胞膜的蛋白占总蛋白的19%。总蛋白的分子功能和生物学过程主要富集在水解酶活性、蛋白质代谢、催化功能等途径，与肝脏作为人体重要的代谢器官相符。ArrayTrack信号传导通路分析结果表明，CM蛋白主要参与了人类疾病相关的信号通路。本研究中选择了在伴有HBV感染的HCC发生过程中起到重要作用的TGF-β通路相关的蛋白质进行分析。比较了此通路中的7个蛋白，MMP1、MMP7、MMP9、OPN（Osteopontin）、PSG9、TIMP1以及AFP在HCC、肝硬化病人及健康人群血浆中的蛋白水平。ELISA结果显示，相比于其他实验组，HCC病人中MMP1、OPN、PSG9血浆水平最高。PSG9的功能进行初步研究结果表明，PSG9是参与肿瘤血管生成的生物分子。双荧光素酶报告基因实验表明PSG9与VEGFA的启动子区具有相互作用。染色质免疫共沉淀将其作用位点定位于VEGFA启动子上游-1684/-1766处。HUVEC成血管实验和Matrigel plug实验表明PSG9具有促进血管生成的作用。结论：本项研究建立了HCC分泌释放蛋白质组数据库，为在血液中寻找相关肿瘤标志物提供了可靠的资源。初步筛选出可供提高HCC诊断效能的分子标志物MMP1和OPN，以及预后相关血浆蛋白OPN和PSG9。