水稻孕穗期耐冷基因CTB4a的克隆与功能机理分析

Rice is a thermophilic crop and sensitive to cold stress, especially at booting stage that can lead to irreparable yield reduction. So it is of great significance to isolate the genes conferring cold tolerance at booting stage in rice. In previous studies, Several NILs containing different QTLs were constructed using a cold-resistant variety from Yunnan “Kunmingxiaobaigu” and a cold-sensitive japonica variety cultivated widely in Japan “Towada”. Among these, We selected for further characterization qCTB4-1 and delimited the qCTB4-1 containing region to 56.8 kb. Nucleotide sequence analysis and expression analysis showed that one ORF was the most possible candidate gene, and designated as CTB4a. The cold resistant function of CTB4a was preliminary validated by transgenic approach. In this study, detail function and mechanism analysis will be conducted using biological, physiological or biochemical techniques, such as the yeast two-hybrid, Co-IP, kinase activity analysis, and so on. In addition, haplotype and evolution analysis will be conducted using the genotype and phenotype data of rice germplasm located in different geographical regions. Meanwhile, marker-assisted selection and marker-free transgenic technology will be used to create excellent cold-resistant genetic materials for breeding.

水稻是喜温作物，对低温敏感，特别是孕穗期低温对产量造成的损失不可弥补，因此对水稻孕穗耐冷基因的克隆与功能机理分析具有重要的意义。在前期研究中，申请人利用水稻孕穗期耐冷云南粳稻“昆明小白谷”和日本冷敏感粳稻“十和田”构建一系列包含不同孕穗期耐冷QTL的近等基因系，在此基础上本研究通过大分离群体将第四号染色体上的qCTB4-1精细定位在56.8 Kb区间内，结合核苷酸序列分析和表达分析确定候选基因CTB4a，构建互补、过表达和RNAi载体，进行遗传转化，初步验证了候选基因的功能。进一步将通过酵母双杂、Co-IP、激酶活性分析等多种分子生物学和生理生化实验技术对其作用分子机理进行解析。此外，利用水稻种质资源的基因型和表型数据对CTB4a进行单倍型和起源演化分析，明确目的基因的起源演化规律，同时还将利用分子标记辅助选择和无选择标记转基因技术创制优异耐冷遗传材料，并分析其耐冷育种利用潜力。

水稻是一种起源于热带和亚热带地区的冷敏感作物，低温冷害是限制水稻生产和地理分布的一个重要限制因素，特别是孕穗期遭遇低温冷害，会导致水稻不能正常发育而严重减产。因此，发掘和克隆水稻生殖生长期耐冷基因，对于阐明水稻生殖生长期耐冷分子机制和开展水稻耐冷分子育种具有重要意义。我们利用孕穗期耐冷高原粳稻和冷敏感粳稻为亲本，通过多年杂交和回交构建一系列孕穗期耐冷近等基因系和定位群体，把其中第4号染色体上的耐冷QTL qCTB4-1精细定位在56.8 Kb区间内，结合核苷酸序列分析和表达分析确定CTB4a为候选基因，其编码一个保守的富含亮氨酸重复的类受体蛋白激酶。通过互补、过表达、RNAi及突变体等一系列遗传材料的创制及耐冷性评价，最终确定CTB4a调控水稻孕穗期耐冷性的功能。进一步研究发现，亲本启动子变异是引起耐冷性差异的根本原因。组织切片观察结果表明CTB4a影响花药的发育从而调节花粉育性，对雌蕊发育没有显著影响。组织表达分析和原位杂交结果表明CTB4a在水稻不同组织中均有表达，特别是茎和花药，绒毡层及花药药隔表达丰度较高, 这与其功能相吻合。亚细胞定位结果表明CTB4a主要定位在细胞表面和叶绿体上。此外，通过酵母双杂交、Co-IP、Pull-down和BiF等研究发现CTB4a与AtpB (ATP合成酶β亚基)互作。低温胁迫下CTB4a过表达植株和NIL1913中的ATP合成酶活性、ATP含量和光合速率均显著高于对照。外源施加ATP能够部分恢复冷敏感亲本的冷敏感性，并且过表达AtpB显著提高水稻孕穗期耐冷性。另外，在中国东北地区和云贵高原的许多品种中，已经包含CTB4a KMXBG耐冷单倍型，比如稻花香、东农428、云稻1号等。CTB4a过表达植株和NIL1913在CS-HAA条件下的实粒数、千粒重和单株产量显著高于Towada，具有潜在的育种利用价值。以上可见，CTB4a基因的克隆为水稻耐冷理论研究积累经验和数据，也为水稻耐冷育种提供了重要的基因资源。这一研究结果对有效保障水稻遭遇低温或寒地种植条件下高产稳产性、促进水稻进一步向高海拔高纬度地区种植发展、解决我国对稻米日益增长的需求有重要意义。