ESCRT相关蛋白在鞭毛/纤毛囊泡分泌中的作用机制

Flagella/cilia emanate from the surface of most eukaryotic cells, perform motile and sensory functions. Recent study demonstrated that flagella/cilia have secretion functions. Flagella/cilia could release ectosome-like vesicles, which carry the bioactive enzymes for long distance cell-to-cell communication. However, the molecular mechanism of the secrection of flagellar vesicles remains unclear. Our preliminary data showed that several ESCRT (Endosomal sorting complex required for transport) proteins are enriched in the ectosome-like vesicles. We propose to fuse these proteins and other vesicle enriched proteins with luciferase to establish a sensitive and rapid assay of the rate of vesicle releasing. We will fuse ESCRT-ralated proteins with YFP or mCherry and use two-photo confocal microscopy to study the process of vesicle releasing. Subcellular localization of endogenous ESCRT-related proteins will be carried out by both immunofluorescence and immunoelectron microscopy. In addition, we will knockdown and knockout ESCRT-related genes, to study their roles on the secrection of flagellar vesicles. Finally, point-mutation of ESCRT-related proteins will be used to dissect the functional sites of these proteins in regulating the secretion. Based on these studies, a molecular model of ESCRT-related proteins in regulating the secretion of flagellar vesicles will be proposed.

鞭毛/纤毛存在于大多数真核细胞表面，具有运动和细胞天线的功能。近期的研究发现鞭毛还具有分泌功能，可以分泌具有生物活性的囊泡至胞外，成为细胞和细胞之间进行物质和信号交流的又一通道，但鞭毛囊泡分泌的分子机理目前还不清楚。我们前期的定量质谱结果鉴定出鞭毛囊泡中富含三个ESCRT相关蛋白，推测它们可能参与调控鞭毛囊泡的分泌。本研究首先利用囊泡中特异性表达的蛋白与荧光素酶融合，建立一种快速检测鞭毛囊泡分泌速度的方法；然后通过双光子共聚焦显微镜实时观察带荧光标签的ESCRT相关蛋白随鞭毛囊泡分泌的动态过程；再通过免疫荧光和免疫电镜对内源性ESCRT相关蛋白进行亚细胞定位；然后敲降和敲除ESCRT相关基因获得突变体，研究其对鞭毛囊泡分泌的影响；最后利用功能位点突变研究ESCRT相关蛋白中的不同结构域对鞭毛囊泡分泌的影响，建立ESCRT相关蛋白调控鞭毛囊泡分泌的分子模型。

纤毛/鞭毛是一类存在于真核细胞表面的细胞器，具有运动、感知及信号传导等功能。近年来的研究发现纤毛还具有分泌功能，其分泌的小囊泡成为细胞与细胞之间进行物质和信息交流的又一载体，但目前对纤毛囊泡分泌的分子机理并不明晰。本研究在纤毛研究模式生物衣藻上展开，首先利用比较蛋白组学的方法鉴定出纤毛囊泡和纤毛膜的蛋白差异；随后建立了快速监测纤毛囊泡分泌速度的方法，并证明纤毛囊泡的分泌参与到纤毛蛋白的更新、纤毛解聚、配子形成、配子交配以及长距离信号传导等细胞过程；然后进一步证明ESCRT相关蛋白PDCD6和VPS4通过调控纤毛囊泡的分泌影响到纤毛解聚及配子形成等生理过程。本项目的研究结果首次报道了纤毛囊泡的蛋白组成，并证明ESCRT相关蛋白参与调控纤毛囊泡的分泌，建立了可能的分子模型，为进一步弄清纤毛的分泌功能及其涉及的细胞生理过程打下基础。