柑橘根结线虫种、生理小种鉴定及其遗传多样性分析

中国是柑橘根结线虫病的最主要发生国，但对该病的研究主要局限于新种的形态描述，对柑橘根结线虫种或生理小种的地理分布、为害特点、生物学特性、分子生物学特性等都缺乏系统研究。申请者拟在前期调查研究基础上，通过对中国柑橘根结线虫病的发生区域、为害特征进行系统调查，对柑橘根结线虫不同种群进行采集、纯化、繁殖，通过传统形态学、同工酶谱、寄主范围测定及分子生物学等方法进行种或生理小种（致病型）的鉴定；对我国柑橘根结线虫的种或生理小种的分类分子遗传信息标记进行系统研究；开发出种特异性的分子标记；对种间或种内群体的遗传多样性和亲缘关系进行分析。研究结果对于查明我国柑橘根结线虫种或生理小种的分布区域及其为害特征，弥补我国在柑橘根结线虫种或生理小种的分类分子标记、遗传多样性方面的研究空白，揭示柑橘根结线虫种间和种内群体与其他根结线虫种的系统发育关系。研究结果对于柑橘柑橘根结线虫病的防控具有重要理论与指导意义。

中国是世界上柑橘根结线虫（Meloidogyne） 病发生最重、种类报道最多的国家，在上个世纪80-90年代，一共报道过12个种，其中6个种为新种，但所有种类都只局限于形态描述，但后期未有相关的研究。本文对全国柑橘根结线虫种类进行了系统的调查，发现柑橘根结线虫目前主要分布在广西桂林地区、广东肇庆等地区，这两个地区种群，经形态学与分子生物学特性进行鉴定，均为同一个根结线虫种，基于rDNA-ITS区、18S区、28S D2-D3区构建采用贝叶斯和最大似然法框架构建的系统发育树，为独立分枝，与其他所有的根结线虫可分开，为一独立种，从形态上鉴定为孔氏根结线虫（M.kongi），同时经过形态比对分析，认为原来在柑橘上报道的新种闽南根结线虫（M.mingnanica）、东海根结线虫(M.donghaiensis）应为孔氏根结线虫的同物异名种。从福建省顺昌县宝庄村发现的1种柑橘根结线虫，通过形态学特征、酯酶和苹果酸脱氢酶酶谱分析、寄主范围测定、分子生物学等方法进行了鉴定，发现该线虫与已描述的根结线虫种存在明显差异，定为根结线虫新种，并根据采集地，定名为顺昌根结线虫（Meloidogyne shunchangensis n. sp.。该根结线虫的形态上与苹果根结线虫(M.mali)为相似种，但基于18S区、28S D2-D3区，采用贝叶斯和最大似然法框架构建的系统发育树，为独立分枝，与苹果根结线虫为姐妹分枝，存在较近的亲缘关系，但是为两个不同的种。根据顺昌根结线虫和孔氏根结线虫的28S D2-D3区引物，分别设计出2种根结线虫的特异性引物对，这两对引物对种具有种异性、稳定性及灵敏度，可用于这两个种的准确鉴定。用中国南方常见的南方根结线虫（M.incognita）、花生根结线虫（M.arenaria）、爪哇根结线虫（M.javanica）、象耳豆根结线虫（M.enterolobii）不同种群来接种柑橘砧木枳壳(Poncirus trifoliata), 这与国外报道一致，阳性对照孔氏根结线虫、顺昌根结线虫可侵染枳砧，并造成严重根结,并产生根结，这表明了国内上个世纪柑橘报道的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫可能是不准确报道。该研究结果有助于澄清了我国柑橘根结线虫种类多、鉴定不规范的状况。