FGF9对骨髓间充质干细胞成骨/成脂分化的双重调控作用及其机制研究

In recent years, the imbalance of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into osteoblasts or adipocytes has become one of the hotspots in the field of osteoporosis. Our previous studies have found that fibroblast growth factor 9 (FGF9) loss of function point mutation (S99N) homozygous mouse showed joint developmental disorder and, unexpectedly, found adult heterozygous mice have significantly increased bone density, accelerated intramembranous osteogenesis rate and increased osteogenesis activity. In vitro osteogenic/adipogenic differentiation studies showed that FGF9 can significantly inhibit the differentiation of BMSCs into osteoblasts and promote differentiation into adipocytes, suggesting that FGF9 may be important for the regulation of osteogenic/adipogenic differentiation of BMSCs. Based on this, the project will use FGF9 overexpression, knockdown in cells and loss of function mutations and conditional overexpression mouse model to study the regulation of FGF9 on BMSCs osteogenesis/adipogenic differentiation and bone metabolism. The molecular mechanism of FGF9 regulating BMSCs differentiation was elucidated by means of RNA-seq, phosphorylation microarray and pathway inhibitor. The expected results will have important theoretical and practical value for understanding the function of FGF9 gene, understanding the pathogenesis of bone metabolic diseases and developing new diagnostic and therapeutic methods.

近年来，骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞抑或脂肪细胞的分化失衡已然成为骨质疏松症研究领域的热点之一。我们前期研究发现成纤维细胞生长因子9（FGF9）功能缺失性点突变（S99N）纯合子小鼠关节发育障碍并意外发现成年杂合子小鼠骨密度显著升高，膜内成骨速率加快，成骨活性增强。体外研究显示BMSCs在成骨/成脂分化诱导条件下，FGF9显著抑制向成骨细胞的分化过程，但对成脂分化具有显著促进作用，提示FGF9可能对BMSCs成骨/成脂分化平衡具有重要调控作用。据此，本项目将利用FGF9细胞过表达、敲低及功能缺失突变和条件性过表达小鼠模型，研究FGF9对BMSCs成骨/成脂分化平衡和骨代谢的调控作用。利用RNA-seq、磷酸化芯片和通路抑制剂等手段阐明FGF9调控BMSCs分化的分子机制。预期结果将对认识FGF9基因功能、理解骨代谢疾病发病机制和开发新型诊断、治疗手段具有重要理论和应用价值。

我国正快速进入老龄化，骨质疏松症发病率逐年攀升，其病因学和新治疗方法的研发面临艰巨挑战。骨髓内骨/脂平衡是骨质疏松症研究的热点之一。我们前期Fgf9基因功能缺失性突变（S99N）小鼠出现成骨增强、骨密度升高表型，进一步研究发现FGF9能显著抑制BMSCs向成骨分化，促进向脂肪细胞分化，提示FGF9与骨代谢调控密切相关。因此，阐明FGF9基因在骨稳态调控中的作用机制是开发以FGF9为靶标治疗骨质疏松症的基础。我们利用Fgf9 S99N突变小鼠模型，结合组织形态学、细胞和分子生物学方法，在体内外水平证明，FGF9显著抑制成骨过程、促进成脂分化和破骨过程，具有显著的负调控骨代谢的作用。进一步利用体外分化和皮下移植模型证明FGF9在BMSCs命运决定期即可发挥抑制成骨分化、促进脂肪分化的调控作用，同时FGF9可以通过促进破骨前体细胞聚集和融合促进破骨细胞分化和骨吸收。为了更加深入理解FGF9调控间充质干细胞和破骨前体细胞的分化命运，我们利用Pathscan、RNA-seq以及通路特异抑制剂等方法，阐明了FGF9蛋白通过结合细胞表面受体选择性激活MAPK/AKT和PI3K/AKT信号通路，改变间充质干细胞成骨/成脂分化平衡，抑制成骨诱导其向脂肪细胞分化，同时通过上述通路与破骨分化激活因子协同促进破骨细胞分化。在此基础上，我们还通过髓内注射的方式证明FGF9重组蛋白可以促进小鼠骨髓脂肪细胞的形成，而FGF9抗体可以显著抑制骨髓脂肪细胞的形成。以上结果证实FGF9是一个重要的骨质平衡负调控因子，它具有成为骨稳态调控靶基因的潜力。我们目前正在重点研究FGF9基因与人类老年骨质疏松症发病的相关性，同时在开发靶向调控FGF9表达水平/功能的方法，为推动FGF9作为老年骨质疏松症治疗新靶点走向临床转化提供实验依据和理论基础。