自噬在三邻甲苯基磷酸酯诱发的神经毒性中的作用

三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）用途非常广泛，其诱发的神经退行性病变的毒性机制至今未能阐明。许多证据表明自噬与神经退行性病变有着密切的关系，Calpain（钙依赖的半胱氨酸蛋白酶）在神经细胞死亡和自噬发生中起着重要的作用。本项目基于前期的研究基础和发现，以TOCP诱发成年母鸡迟发性神经毒性模型，观察细胞自噬、凋亡、坏死等在毒性效应产生过程中的权重，同时结合细胞模型，确定自噬与TOCP神经毒性的关系。在此基础上，通过工具药物（Calpain的特异性抑制剂ALLN和自噬的特异性抑制剂3-MA）、RNA干涉（敲减自噬发生的关键基因Atg7和Beclin1）以及诱导分化等策略研究和揭示自噬在TOCP神经毒性中的作用机制。研究结果不仅深刻揭示TOCP的神经毒性机制，拓宽对有机磷酸酯类化合物神经毒性的认识，而且有助于进一步理解和揭示神经退行性病变的机理，对于发展新的防治策略亦具有一定的指导意义。

三邻甲苯基磷酸酯（TOCP）用途非常广泛，其诱发的神经退行性病变的毒性机制至今未能阐明。. 本项目应用整体动物试验和体外实验相结合，以成年广东清远母鸡为实验动物，以SH-SY5Y细胞系为细胞模型，染毒TOCP，明确自噬与TOCP的神经毒性关系。然后利用RNA干涉技术，构建自噬干预的神经细胞模型，结合Calpain抑制剂和自噬特异性抑制剂的应用研究自噬相关基因和Calpain在TOCP神经毒性中的作用。在此基础上，利用这些细胞模型，通过诱导神经细胞分化，进一步详细阐明TOCP处理过程中自噬机制在抑制细胞分化和降解神经突起的作用，并确认Calpain的激活对自噬形成的作用。结果发现：（1）TOCP对实验母鸡脊髓、坐骨神经中的自噬相关蛋白LC3和溶酶体相关膜糖蛋白（LAMP-1）的表达有影响，随着染毒时间的延长，蛋白表达均增多；提示TOCP诱发的OPIDN与自噬的发生有关。（2）TOCP能够诱导人成神经瘤细胞SH-SY5Y细胞自噬，利用构建自噬干预的神经细胞模型，发现Beclin1基因参与TOCP引起的SH-SY5Y细胞产生的自噬，抑制Beclin1基因可抑制TOCP 促使TOCP引起SH-SY5Y细胞产生凋亡。（3）TOCP能诱导已分化与未分化的SH-SY5Y细胞calpain活性，T/L-型钙离子通道和内质网上的IP3R参与细胞内钙紊乱，calpain激活参与调控TOCP诱导的自噬。TOCP能诱导未分化的SH-SY5Y细胞20S蛋白酶体T-L、CT-L、PGPH和26S 蛋白酶体CT-L、PGPH活性增高，抑制26S 蛋白酶体中T-L活性，TOCP能调节泛素化蛋白酶体途径。（4）发现TOCP能够激活PKC。PKC信号转导在TOCP的神经毒性机制中扮演中重要角色。. 本研究通过建立合理有效的动物模型和细胞模型，明确了自噬参与了TOCP诱发迟发性神经毒性发生发展，确定了自噬与TOCP诱发神经毒性的关系；详细阐明了TOCP处理过程中自噬机制在神经细胞突起维持中的作用，并确认Calpain的激活对自噬形成的作用；自噬对TOCP诱发神经分化和轴突退变的影响。研究结果不仅有助于揭示TOCP的神经毒性机制，也有助于拓宽对其它诱发迟发性神经毒性的有机磷酸酯类化合物的神经毒性认识，对进一步理解和揭示神经退行性病变的机理，发展新的防治策略亦具有一定的指导意义。