大黄提取物对肠黏膜血管内皮连接蛋白及其信号机制的影响

肠黏膜屏障破坏可促发多器官功能障碍综合征（MODS），目前缺乏防治手段。申请者率先在国内外采用大黄生药保护肠黏膜，研究显示大黄能抑制肠道细菌易位，改善肠黏膜血流灌注，但药理机制尚不清楚。本项目提取大黄有效成份，以肠道细菌易位、肠上皮细胞增殖和凋亡、细胞间连结蛋白的表达等为指标研究其对肠黏膜的保护作用。通过活体显微镜、免疫荧光、免疫印迹和PCR等技术观察大黄提取物对肠黏膜毛细血管网、功能毛细血管密度和新生血管形成的影响；对肠黏膜血流量和毛细血管通透性的影响；对血管内皮细胞间黏附连接蛋白（VE-cadherin）和紧密连接蛋白（claudin、 ZO）分布的影响，以及在基因和蛋白质水平表达的影响；是否通过细胞内信号通路（PI3K/AKT -Rac1）调节VE-Cadherin的表达；探讨可溶性VE-Cadherin与毛细血管渗漏的关系。明确大黄提取物的药理机制，开发防治肠衰竭和MODS的新药。

本项目首先通过检测小肠血流量及肠组织的氧供，肠粘膜毛细血管面积和新生毛细血管的数量，明确大黄对脓毒症大鼠肠微循环和毛细血管的保护作用。再萃取大黄，并用上述方法检验各个部位药物的活性。然后通过色谱分离方法进一步分离和纯化并鉴定获得的单体，通过检测大黄单体对单层脐静脉内皮细胞通透性和细胞增殖的影响筛选出有活性的化合物。动物体内检测大黄单体对肠黏膜通透性、小肠黏膜形态和内皮细胞凋亡的影响，以及对血管内皮细胞间紧密连接蛋白（claudin-5、 ZO-1、occludin）的表达的作用。在体外检测大黄单体对血管内皮细胞钙粘蛋白：VE-cadherin，紧密连接蛋白：ZO-1, Occludin, Claudin-5的基因、蛋白表达的影响；最后通过检测Akt的磷酸化水平，Rac1的活化情况以及VE-cadherin的表达和肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化水平，明确大黄单体作用的信号机制。.取得的成果：（1）大黄可以扩张肠粘膜毛细血管、减少血栓形成、保护肠粘膜毛细血管内皮细胞，增加肠粘膜功能毛细血管数量。（2）大黄的石油醚、二氯甲烷萃取部位可以改善脓毒症肠组织的氧合；二氯甲烷萃取部位可以增加肠粘膜毛细血管CD31的表达；石油醚萃取部位明显的扩张了肠粘膜的毛细血管面积。（3）获得21种大黄单体化合物。体外实验发现：大黄酸，大黄素，3,8-二羟-1-甲基蒽醌-2-羧基酸，1-O-咖啡酰基-2-（4-羟基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖，胡萝卜苷亚油酸酯对炎症因子损伤的血管内皮细胞具有保护作用，可以降低单层血管内皮细胞的通透性。（4）大黄单体能够减轻肠黏膜上皮细胞凋亡，促进黏膜细胞的增殖，保护肠道粘膜屏障功能。（5）大黄单体增强肠粘膜上皮细胞连接蛋白claudin-5,occludin和ZO-1的表达，保护肠黏膜屏障。（6）大黄单体能有效降低脓毒症大鼠肠黏膜通透性，保护肠黏膜屏障。（7）大黄单体能够修复基质金属蛋白酶-9损伤的人脐静脉血管内皮细胞的细胞形态和钙粘蛋白：VE-cadherin，紧密连接蛋白：ZO-1, Occludin, Claudin-5。（8）作用机制：大黄单体一方面通过PI3K/Akt途径抑制Rac1的活化，升高内皮细胞粘附连接蛋白VE-cadherin的表达；另一方面抑制收缩内皮细胞的肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化改善血管内皮通透性。