基于信号放大策略的数字式液滴悬浮编码阵列的构建及其在蛋白超灵敏、多重指标联合检测的方法研究

In order to meet the urgent requirements of ultra-sensitive and multiplex immunoassay for numerous disease-related low abundance proteins, the project aims to develop a multiplex single molecule digital immunoassay based on microdroplet microfluidics via signal amplification strategy. Signal amplification system, founded on the spherical polyelectrolyte brushes with high enzyme immobilization efficiently, will be firstly established. Next, a new kind of host-guest structured fluorescent encoded microspheres with an ultralow nonspecific adsorption property will be controllably prepared and act as biocarriers to identify and captured multi-target proteins. It is necessary to ensure that one specific target protein molecule conjugates onto the surface of corresponding encoding microsphere through adjusting the ratio of encoded microspheres and target proteins at most. Then, combined with signal amplification system, “Encoded Microsphere-Target Protein-Brush” complex would be formed. After that, we will build a droplet-based microfluidic digital biodetection platform and ensure that each droplet contains at most one specific complex to be detected, so as to achieve the single molecular, digital and multiplex assay for multi-target proteins. Because of employing signal amplification combined with encoded microsphere strategy in picoliter scaled droplet to identify and analyze ultralow abundance protein, it is expected to significantly enhance conventional protein detection sensitivity. It might pave, in a timely fashion, a new way of extending droplets based detection technique in single molecular and multiplex protein assay.

针对众多与疾病密切相关的极低丰度蛋白检测时需要实现超灵敏、多重指标联合检测的迫切要求，本课题旨在构建集成信号放大策略、荧光编码微球和微珠基液滴微反应器的蛋白单分子、多重指标联合检测的新方法。首先构建聚电解质纳米球刷高效荷载酶的信号放大系统；其次可控制备具有低非特异性吸附性能、主客体结构的荧光编码微球并作为鉴别多靶标蛋白的载体，调控微球与靶标蛋白的比例，确保每个编码微球至多连接一个特定靶标蛋白，联合纳米球刷信号放大系统形成“编码微球—靶标蛋白—纳米球刷”复合物；最后，构筑微流控液滴微反应器检测平台，确保每个液滴中至多含有一个待检复合物，进而实现多靶标蛋白的单分子、数字式、多重指标联合检测目的。由于在皮升尺度的微液滴中采用信号放大策略联合荧光编码微球识别、检测超低丰度多重靶蛋白的方式，有望大幅提高蛋白检测灵敏度的同时实现单管多重检测，是液滴基检测技术在蛋白单分子、多指标检测领域的全新尝试。

针对众多与疾病密切相关的极低丰度蛋白检测时需要实现超灵敏、多重指标联合检测的迫切要求，本项目聚焦可快速生成无限量分区的高通量液滴微流控平台，采用独创的“结构-荧光”编码微球库作为鉴别、捕获靶蛋白的载体，构建了新型“编码微球-液滴”基微流控芯片，并在此基础上发展了多重蛋白数字式超灵敏生物检测新方法。.首先，针对如何突破泊松分布限制，实现液滴中单个编码微球装载率大幅提高的瓶颈问题，创新提出了一种集微球排列、液滴生成与微球包裹的集成式“编码微球-液滴”微流控芯片(bead ordered arrangement droplet system, BOAD)。BOAD系统将包裹有单个编码微球的液滴分区比例大幅提升至86%，是常规液滴包裹微球检测体系的9倍。进一步地，在直径为30μm的皮升尺度液滴中，创新性地提出长、短曝光时间的二次成像解码策略(DET)，解决了悬浮在液滴中编码微球无法在同一焦平面聚焦成像的难题，实现了54重直径仅为3μm的双色荧光编码微球在皮升液滴中的高效包裹与精准解码。.其次，设计并制备液滴隔离式储存微腔阵列芯片(DIA)，有效地抑制了荧光分子在液滴间的扩散与信号串扰问题，保证了液滴中荧光信号的稳定性和数字式信号读取的准确性。同时，利用多聚酶作为信号放大单元，克服了单酶无法催化液滴中底物快速生产数字信号的难题。在此基础上成功构建了集成信号放大策略、荧光编码微球和微珠基液滴微反应器的蛋白单分子、多重指标联合检测系统。.最后，以多重细胞因子作为模式待测靶标，在构建的“微球-液滴”芯片上实现了多重蛋白分子在编码微球表面的单分子高效捕获、装载有“单微球-单分子蛋白”的液滴中编码微球信号的准确鉴别、单分子靶标信号放大与单分子检测。构建的多重蛋白数字式检测系统的检测灵敏度均达到亚fM水平，且相比于传统的多重悬浮芯片技术，检测灵敏度提升了3～40,000倍。.综上，本项目构建的多重、超灵敏数字式蛋白检测新方法有效解决了当前数字ELISA检测技术中难以提高检测重数的瓶颈问题，是集多重、超灵敏、通用性与实用性于一体的新型数字式多重蛋白检测平台，同时该方法还可以拓展应用至多重核酸的数字式超敏检测。