天然产物Glaucocalyxin H 的抗肿瘤作用靶点确证及分子机制研究

Identification of target protein and the molecular mechanism of action by the design and synthesis of molecular probes based-on bioactive natural products is a hot research field. Glaucocalyxin H (GLH) is a new diterpenoid isolated from the medicinal plant Isodon japonica var. glaucocalyx in our previous studies. The results of antitumor activity evaluation showed that GLH has potent in vitro and in vivo antitumor activity, and the results of molecular pharmacology suggested that the expression imbalances of Bax/Bcl2 played an important role in apoptosis.But its target protein and the molecular mechanism of action remained unclear. In this project we try to: (1) design and synthesize the molecular probes labeled with biotin and fluorescein by structural modification based-on lead compound GLH,and evaluate their antitumor activity; (2) enrich and purify the target protein using chemical probes labeled biotin by immunoprecipitation technology and affinity chromatography, then further separate by SDS-PAGE, and finally identify the target protein of GLH by sequencing analysis of amino acid based on Mass-spectrum and analysizing the protein structural information; determine the subcellular location of target protein using chemical probes labeled fluorescein by cell imaging and molecular biology method；（3）elucidate the molecular mechanism of antitumor action based-on the target protein identified. The results of this program will provide the new target proteins and biomarker for the design,synthesis and structural optimization of the antitumor drugs, and provide the theoretical and technological basis for the development of natural antitumordrugs.

基于活性天然小分子结构，设计合成分子探针研究其作用靶点和分子机制是目前的热点领域。我们前期从蓝萼香茶菜中分离鉴定了新结构的二萜Glaucocalyxin H (蓝萼辛素，GLH)，活性评价及分子药理学研究表明其有良好的体内外抗肿瘤活性，且Bcl2/Bax表达失衡是其诱导细胞凋亡的主要因素，但其作用靶点与机制不明。本项目拟：（1）以GLH为先导化合物，通过非活性部位结构修饰，设计合成具有活性的生物素和荧光标记的分子探针；（2）运用免疫共沉淀、亲和层析和蛋白组学技术，以分子探针钓取富集、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱分析和蛋白信息数据库比对，确定GLH的作用靶点；运用细胞内成像等技术，以荧光标记的分子探针确定GLH作用靶点的亚细胞位置；（3）根据确定的靶点探讨GLH抗肿瘤作用的分子机制。为基于靶点的抗肿瘤药物设计合成、肿瘤诊断提供新靶点和生物标记物，为抗肿瘤天然药物的研发提供理论依据和技术支撑。

基于活性天然小分子结构，设计合成分子探针研究其作用靶点和分子机制是目前的热点领域。本项目以来源于蓝萼香茶菜的天然抗肿瘤二萜蓝萼甲素（Glaucocalyxin A，GLA）和蓝萼辛素（Glaucocalyxin H，GLH）为研究对象：（1）在保留其药效基团α，β-不饱和环戊酮的情况下， 通过对分子中非活性部位7-OH，14-OH，3-羰基进行结构修饰， 设计合成表征了40个生物素/荧光标记的和含末端炔基非标记的小分子探针，均为新化合物，探索了结构复杂活性天然产物其分子探针设计合成的方法；（2）MTT法评价了40分子探针对人肝癌HepG2细胞和人宫颈癌Hela细胞体外抗肿瘤活性，发现8个分子探针对HepG2细胞显示了较强的体外抗肿瘤活性（IC50小于20M），其中4个活性探针为含末端炔基未标记的分子探针，另外4个活性探针为生物素标记的分子探针。探针构效关系分析表明，7-OH，14-OH缩醛化的分子探针均不具有活性，可能是缩醛化成环后的刚性结构影响了α，β-不饱和酮活性基团与靶点分子的巯基发生迈克尔加成反应（Michael addition）；（3）选择活性最好的生物素标记的探针化合物65a/b（HepG2，IC50，9.31M），通过亲和层析和分子生物学等方法富集、分离、纯化等技术方法，钓取得到了GLH二萜类化合物对HepG2细胞的作用靶点，质谱分析结果表明分别为Albumin和HistoneH4蛋白。其中组蛋白HistoneH4是核小体的核心成分，其在转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性方面发挥着核心作用，其与肿瘤的发生发展有一定关系；（4）形态学观察及分子生物学实验结果表明，GLH类化合物是通过内源性途径诱导细胞凋亡而发挥抑制肿瘤细胞增殖作用。该项目钓取鉴定的作用靶点组蛋白HistoneH4为进一步研究该蛋白与凋亡之间的关系奠定了基础。