我国部分城市环境水系中军团菌分离株遗传多态性研究

Legionella pneumophila is a Gram-negative, facultative, intracellular pathogen that accounts for the majority of cases of Legionnaires' disease. For the first time, we are planning to sample the natural water bodies of the 30 capital cities of mainland China provinces, aiming to isolate and identify Legionella. For the isolates, we will briefly classify them into L. pneumophila and non-pneumophila Legionella. For the non-pneumophila Legionella, classical phenotypical assays and 16S rRNA sequencing will be performed to designate their taxonomic status. Should the strains fail to be put into known taxons, more detailed polyphasic taxonomic assays are needed to qualify them as novel species. For L. pneumophila, serotyping, Sequence-based typing (SBT), Multi-loci VNTR Analysis (VNTR) and even genome sequencing are carried out to decipher the population structure and phylogenic patterns of the environmental Legionella pneumophila strains. By probing the virulence-related genes of L. pneumophila, it will be feasible to predict their potential to cause outbreaks. Combining the genetic diversity data and geographic data will enable us to reconstruct the microevolution scenarios. With data obtained here, we will bring up unprecedented understandings of the background of Legionella contamination in Chinese natural water bodies, and their genetic diversity as well, which will by all means help us to be prepared for Legionnaires disease outbreaks in the near future.

军团菌是重要的胞内寄生病原菌，能引起军团菌病，对人民健康构成威胁。本课题拟首次采集我国内陆30个省会城市的环境水系（包括主要江河以及城市湖泊等）水样，进行军团菌分离培养；通过表型分析与核酸序列分析，确定我国非嗜肺军团菌环境菌株的构成，有望发现一批军团菌新种；对于嗜肺军团菌，采用血清学分型、基于序列的分型（Sequence-based Typing）、多位点VNTR分析（Multi-locus VNTR Analysis，MLVA）以及基因组序列测定等技术，研究其群体遗传学结构与系统发育关系；通过研究环境菌株中毒力基因分布情况，对其侵染潜力进行预评估。菌株遗传多态性数据结合地理信息，有助于了解军团菌环境菌株微进化规律以及系统发生模式。本课题的开展将系统了解我国重要城市环境水体中军团菌环境污染情况、本底组成以及遗传多态性，对于预防和控制突发性军团菌病的暴发流行、进行快速病原学诊断提供科学依据。

军团菌是重要的胞内寄生病原菌，能引起军团菌病，对人民健康构成威胁。军团菌病不能在人与人之间传播，只能由环境传播到人类，因此加强军团菌环境菌株的研究，对于军团菌病的溯源，研究临床菌株与环境菌株之间的关系等都有重要意义。本研究首次关注我国主要城市自然水体中军团菌的分布情况，取得以下重要结果：.1.建立了从环境水体中高效分离军团菌的方法，热富集浓缩预处理方法的培养阳性率显著高于离心浓缩和膜过滤浓缩处理水样的培养阳性率。.2.在我国31个城市自然水体中采集了550份水样，从中分离到404株非冗余军团菌，其中嗜肺军团菌146株，占36.1%，是最常见的军团菌。在非嗜肺军团菌中，长滩军团菌、菲氏军团菌和戈尔曼军团菌最常见。只有两个城市（拉萨和西宁）水样中未分离到军团菌。军团菌的种类在各个城市间的分布存在着差异。75份水样同时存在两种以上的不同军团菌，显示在中国的自然水环境中，军团菌普遍存在且具有高度的多态性。.3.我们140株嗜肺军团菌进行了序列分型（sequence-based typing, SBT），可分为84个序列型（STs），多样性指数为0.988 (95% CI: 0.983-0.992)，84个序列型中有31个序列型与EWGLI的SBT数据库中已有序列型相同，53个为首次发现的新序列型，同时还发现11个新的等位基因。.4.群体遗传学分析表明， 140株嗜肺军团菌形成10个克隆复合体（clonal complexes，CCs）和47个singletons，其中CCI为中国自然水环境中的优势克隆复合体，有两个（ST239和ST1439）为致病序列型，提示CCI菌株可能会引起疾病。而中国人工环境中最常见的ST1-克隆复合体在自然水环境中并不是很常见，在本研究的140株菌中，未发现基因内重组事件，但发现了多个基因间重组事件。.5.通过比较发现，不同环境与地区菌株在分子水平上的差异并不显著，但自然水环境菌株与人工水环境菌株之间却存在着显著的差异，前者遗传多样性明显高于后者。. 本课题首次摸清了我国重要城市环境水体中军团菌环境污染情况、本底组成以及遗传多态性，对于预防和控制突发性军团菌病的暴发流行、进行快速病原学诊断具有重要意义。