叶酸靶向载TFPI-2表达质粒和顺铂磁性纳米复合物联合放疗治疗鼻咽癌的研究

Targeted chemotherapy and gene therapy have become two research hotspots for the treatment of tumor, but so far, no report is found on combined radiotherapy, targeted chemotherapy and gene therapy for nasopharyngeal carcinoma (NPC). On the basis of the first two items of National Natural Science Funds, folic acid targeting PEG-PEI-Alg-Fe3O4 magnetic nanoparticle coupling cisplatin (FA-MNP-CDDP) will be prepared by chemical method, and the composite of FA-MNP-CDDP adsorbing TFPI-2-green fluoresent protein expression vector will be used for targeted therapy combined with radiotherapy for NPC in this project. Furthermore, not only the physicochemical characteristics, gene transfection efficiency, capacity of targeting NPC of the magnetic nanocomposite and its distribution in tissue of NPC-bearing nude mice, but also the expression of mRNA and protein of TFPI-2 in folic receptor (FR) positive HNE-1 cell before and after gene transfection as well as the inhibiting effect of the composites combined with radiotherapy for NPC in vitro and in vivo will be studied by HPLC, atomic absorption spectrometry, RT-PCR, Western-blot, flow cytometry, Matrigel invasion test, cell cloning, immunohistochemistry and TUNEL. The purpose of this study is to explore the feasibility and validity of combined molecular targeted therapy for NPC, and provide an experimental basis for clinical application.

靶向化疗及基因治疗已经成为肿瘤治疗研究热点，但目前尚未见联合放疗、化疗、靶向基因综合治疗鼻咽癌（NPC）的研究。本项目在前两项国家自然科学基金资助基础上，拟采用化学方法制备偶联顺铂（CDDP）的叶酸靶向PEG-PEI-Alg-磁性纳米粒（FA-MNP-CDDP），吸附表达绿色荧光蛋白和TFPI-2质粒的复合物联合放疗对NPC进行综合靶向治疗。通过HPLC、原子吸收光谱法、RT-PCR及Western-blot法、流式细胞术、Matrigel侵袭实验、细胞克隆实验、免疫组化、TUNEL法等，研究该磁性纳米复合物的理化特征、基因转染效率、对NPC的靶向性、在荷鼻咽癌裸鼠体内的分布、转染前后叶酸受体阳性HNE-1细胞TFPI-2 mRNA和蛋白表达、以及联合放疗对NPC的体内外抑制效应。探索分子靶向综合治疗方法的可行性和有效性，为临床应用提供实验依据。

靶向化疗及基因治疗已经成为肿瘤治疗研究热点，但目前尚未见联合放疗、化疗、靶向基因综合治疗鼻咽癌（NPC）的研究。本项目在前一项国家自然科学基金资助基础上，通过酰胺化反应合成新型阳离子聚合物（FA-PEG-PEI），醛基化海藻酸钠改性的Fe3O4磁性纳米颗粒偶联顺铂（SPION-CDDP）后与上述聚合物组装，再通过静电作用吸附表达绿色荧光蛋白和组织途径抑制因子2（TFPI-2）质粒得到终产物叶酸靶向共载顺铂和TFPI-2磁性纳米复合物（FA-PEG-PEI@SPION-CDDP-TFPI-2）。通过透射电镜、激光粒度检测仪、磁强计、核磁氢谱、红外线光谱等检测了该磁性纳米复合物的理化特征；Western-blot法、流式细胞术、Matrigel侵袭实验、细胞克隆实验，细胞磁共振，铁染色及GFP蛋白表达实验研究了该复合物转染前后叶酸受体阳性HNE-1细胞TFPI-2 质粒的表达， 对鼻咽癌肿瘤细胞的抑制作用及对NPC的靶向性及基因转染效率；通过体内外实验研究了该复合物的生物安全性、在动物体内的组织分布、磁靶向及叶酸靶向分布、对鼻咽癌细胞及裸鼠移植瘤的抑制效应和联合放疗对NPC的体内外抑制效应。理化性质表征结果显示，该磁性纳米复合物呈球形，水动力学平均粒径约为149.5nm，Zeta电位14.89±1.83mv， CDDP包封率为45.2%，CDDP药物浓度为120ug／ml。 DLS和凝胶电泳显示该复合物对TFPI-2 pDNA有保护作用。体内外试验证实，该复合物对叶酸受体表达阳性HNE-1具有良好的靶向性和较高的基因转染效率，联合放疗对NPC具有明显的抑制作用，可用于叶酸受体阳性鼻咽癌的靶向治疗。上述研究结果为NPC细胞的叶酸分子靶向和磁靶向提供了体内外实验依据，进一步说明分子靶向综合治疗的方法具有可行性和有效性。为将来临床应用奠定了理论基础并提供了实验依据。