兔肠艾美耳球虫转染体系的建立

目前市场上缺乏抗兔球虫有效疫苗和新型药物，同时兔球虫用做肠道粘膜部位的真核表达载体具有独特的生物学优势和深远的科学意义。而转染技术是后基因组时代研究保护性抗原、药物靶位和真核表达载体的最有效工具之一。但目前尚未有兔球虫转染体系的报道。本研究拟以兔肠艾美耳球虫为模型，以yfp或rfp为报告基因构建兔球虫转染载体，以电转染和体外细胞培养建立兔球虫瞬时转染系统，在此基础上筛选优秀启动子，并优化电转染方法以提高转染效率；然后通过流式分选和兔体内传代的策略建立稳定转染系统，并在此基础上对稳定转基因兔球虫进行基因组和表型分析；另外，在建立瞬时转染系统的基础上，研究不同类型启动子、信号肽和跨膜区序列在兔球虫体内对外源基因的时空表达调控情况。该研究结果将有力推动兔球虫保护性抗原和药物靶位基因的研究，加快兔球虫病新型药物和疫苗问世，同时拓展以兔球虫为活疫苗载体的研究。

兔球虫为肠道内寄生虫原虫，能够激发宿主较强的粘膜免疫应答，兔球虫转染系统的建立能够为兔球虫用作新型真核表达载体奠定基础，同时也有助于兔球虫病疫苗的研发。目前已公认的兔球虫种类有11种，肠艾美耳球虫（Eimeira intestinalis）被认为免疫原性最强的兔球虫。本研究旨在以E. intestinalis为模式兔球虫，建立起转染系统。经过3年来的不懈努力，本项目取得了如下几个方面的重要结果：1、建立了E. intestinalis瞬时电转染系统。在该系统中，E. intestinalis子孢子能够表达YFP，子孢子电转染效率约为0.01‰，发光子孢子可见于接种后第48小时，能够在原代兔肠道细胞上发育至第一代裂殖子；2、建立了E. intestinalis稳定电转染系统，获得了YFP转基因虫株1株，该虫株的发光效率在80%以上。3、对YFP转基因E. intestinalis虫株的生活史、繁殖力和免疫原性进行了研究，绘制了E. intestinalis生活史动态发育图谱，与野生父代虫株相比，转基因虫株的繁殖力明显降低，但却保留了较强免疫原性，适合用做弱毒疫苗株。4、对E. tenella组蛋白4核靶位序列（NLS）和弓形虫GRA8信号肽序列的调控功能进行了鉴定，NLS能够调控YFP蛋白打靶到细胞核部位。以上研究结果表明，E. intestinalis是适合用做外源基因的真核表达载体，这为基于兔球虫载体的新型病毒或细菌病疫苗的深入研究奠定了基础。另外，在顺利开展项目计划内研究内容的同时，我们还获得了计划外的一些相关研究结果：1、鉴定了E. intestinalis浙江分离株。该虫株为弱毒株，免疫原性较强，5000个卵囊免疫后的免疫保护率100%，免疫兔无临床症状，卵囊减排率可高达84.45%。E. intestinalis浙江分离株是的优良疫苗候选弱毒株；2、试制出治疗兔球虫病的高效复方口服制剂1种。应用该制剂后，试验兔的卵囊减排率可高达99.22%。这为兔球虫病防治和无球虫兔培养提供了重要手段。3、分离并鉴定出粗糙肾形虫（Colpoda aspera）1株，并设计出适合其生长的纯化学培养基2种。在本课题项目的支持，正式发表学术论文3篇，其中SCI论文2篇，中文一级核心期刊论文1篇, 另有2篇中文论文被录用，待刊出。