纳米二氧化硅经PERK/TFEB通路诱导肝细胞自噬功能紊乱的机制研究

Autophagy dysfunction is a potential toxic mechanism of nanomaterials. The transcription factor EB (TFEB) is a master regulator of the autophagy-lysosomalpathway (ALP). Our previous study confirmed that silica nanoparticles (SiNPs) and induced autophagy dysfunction in hepatocytes, while the mechanism underling autophagy triggered by SiNPs remains unclear. Firstly the PERK signaling pathway, the activity of calcineurin and phosphorylation level of TFEB were measured in vivo and in vitro to explore the effect of PERK pathway activated by SiNPs on TFEB nuclear translocation. Then the effect of PERK/TFEB regulatory pathway on autophagy induced by SiNPs was explored in conditional TFEB knockout mice and TFEB knockout stable cell lines. The high-throughput Biomark HD system are used to screen and select the key genes regulated by TFEB nuclear translocation activated by SiNPs. Then further verify the effect of target genes on autophagic function.At last try to clarify the mechanism underlying the role of PERK/TFEB regulatory pathway in autophagy dysfunction induced by SiNPs in hepatocytes. The present study will provide theoretical basis for the toxic mechanism of SiNPs.

自噬功能紊乱是纳米材料的重要毒性机制，转录因子EB（TFEB）是调节自噬-溶酶体途径的关键分子。课题组前期研究已证实纳米SiO2诱导肝细胞自噬功能紊乱，但其诱导自噬过程的机制尚不十分清楚。本课题首先在体内体外条件下，检测PERK信号通路变化、钙调磷酸酶活性、TFEB磷酸化水平改变，以明确纳米SiO2经PERK通路对TFEB核转移的影响；利用TFEB条件性基因敲除小鼠和TFEB基因敲除细胞系，研究PERK/TFEB调控通路对纳米SiO2诱导自噬的影响；采用Biomark HD高通量基因分析系统筛选确认纳米SiO2通过TFEB调控的自噬相关基因；体外条件下进一步验证靶基因对纳米SiO2诱导肝细胞自噬过程的影响。最终阐明PERK/TFEB调控通路在纳米SiO2诱导肝细胞自噬功能紊乱中的作用及分子机制。本研究将为纳米SiO2毒性机制研究和安全性评价提供理论依据。

自噬功能紊乱是纳米材料的重要毒性机制，转录因子EB（TFEB）是调节自噬-溶酶体途径的关键分子。课题组前期研究发现纳米二氧化硅诱导肝细胞自噬功能紊乱，但具体机制不清。本项目研究纳米二氧化硅通过TFEB调控肝细胞自噬功能紊乱的分子机制，以人正常肝细胞L-02为模型，透射电镜下观察纳米二氧化硅的细胞摄取、细胞内分布和对亚细胞器的损伤；利用CCK8试剂盒检测细胞毒性；免疫荧光联合应用激光共聚焦显微镜观察纳米二氧化硅对TFEB核转移的影响；利用CRISPR-Cas9技术构建TFEB敲除（KO）L-02细胞系，研究TFEB在纳米二氧化硅诱导自噬过程中的作用；采用RNA-seq和生物信息学结合人类自噬数据库（Human Autophagy Database）关联分析，筛选纳米二氧化硅通过TFEB调控自噬过程的关键基因；利用免疫共沉淀（Co-IP）验证TFEB调控的关键靶分子在纳米二氧化硅诱导自噬过程中的功能。研究结果：纳米二氧化硅被细胞摄取后可产生细胞毒性，抑制L-02细胞增殖并存在剂量和时间效应；纳米二氧化硅增强肝细胞内自噬体的积累并促进TFEB转移入核；纳米二氧化硅通过促进TFEB核转移激活自噬，敲除TFEB抑制了纳米二氧化硅诱导的自噬；纳米二氧化硅激活TFEB的机制依赖于内质网应激的PERK信号通路激活，而不是通过经典的mTOR信号通路抑制；纳米二氧化硅通过TFEB可上调自噬溶酶体基因HSPB8、ATG4D、CTSB和CTSD的转录表达；HSPB8是纳米二氧化硅通过TFEB调控自噬的关键基因，HSPB8与BAG3和HSC70相互作用形成分子伴侣辅助性选择性自噬（CASA）复合物，进而靶向泛素化的蛋白质到自噬体中，触发HSPB8辅助性选择性自噬促进自噬体合成，加剧自噬功能紊乱。本研究阐明了纳米二氧化硅诱导自噬的新机制，有助于进一步研究纳米二氧化硅的毒性机制和风险评估。