小麦TaGAPC1基因响应逆境胁迫的分子机制研究

Abiotic stress is a complex environmental constraint that limit the wheat production and yield. Thus, understanding the molecular mechanism for abiotic stress response in wheat could provide important information for genetic improvement. In previous work, we identified 13 glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) genes from Triticum aestivum cv. Chinese Spring, and one of the genes TaGAPC1 showed responding to abiotic stresses dramatically. To further explore the details of TaGAPC1 stress-resistance, this project plans to study on four aspects. Firstly, constructing and analysis of a stresses cDNA library, and obtained over-expression and silence of TaGAPC1 transgenic wheat. Secondly, screening transcription factors interacting with promoter of TaGAPC1 by yeast one-hybrid and interacting proteins of TaGAPC1 by yeast two-hybrid. Thirdly, acquire transcriptional profiles of TaGAPC1 in wheat tissues and under abiotic stress by detecting the level of mRNA. Fourth, make clear the way of TaGAPC1 stress-resistance in wheat through comprehensive analysis RNA-sequence and metabolomic datum of transgenic and wild-type wheat under stresses. Through these studies, it is expected to elucidate the molecular mechanism of TaGAPC1 in response to abiotic stresses, thus providing genetic resources and theoretical basis for the stress-resistant wheat heredity and breeding research.

逆境胁迫是造成小麦减产的主要因素，研究小麦响应逆境的分子机制具有重要意义。申请人在前期工作中从小麦中国春中筛选出13个GAPDH基因，RT-qPCR分析显示其中TaGAPC1基因在逆境胁迫下转录水平显著升高。为探索TaGAPC1基因在小麦逆境响应中的分子机制，本项目拟从以下四方面进行研究：1、构建逆境胁迫下小麦的cDNA文库及EST分析，获得该基因的过表达和沉默的转基因小麦；2、分别通过酵母单杂交和酵母双杂交筛选与其启动子结合的转录因子和与其蛋白结合的互作蛋白；3、检测TaGAPC1基因在小麦各组织中转录水平的表达情况以及在不同时间胁迫下的表达情况，确定其组织表达谱和诱导表达谱；4、结合转基因小麦和正常小麦在逆境胁迫下的转录组测序和代谢组学分析，分析小麦对非生物胁迫的响应机制。通过上述研究，有望揭示TaGAPC1基因响应逆境胁迫的分子机制，从而为抗逆小麦遗传育种提供新的基因资源和理论基础。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是糖酵解过程中一种关键酶，广泛存在于各个生物体中，在植物生长发育中发挥重要作用。本项目从小麦胞质TaGAPCs基因及启动子出发，探索其可能参与的抗旱分子机制。结果表明：TaGAPCs在小麦不同组织中均有表达并在渗透胁迫下其表达量几乎都显著上升，除此之外TaGAPCs启动子序列上包含有特异性响应非生物胁迫的元件，表明TaGAPCs可能参与小麦响应干旱胁迫的过程。为了进一步探究其分子机制，构建了干旱胁迫下小麦叶片的全长均一化cDNA文库，通过将构建的文库质粒转入酵母Y187中，获得了可用于酵母单双杂交的cDNA文库，从而通过酵母单双杂交技术筛选得到转录因子TaWRKY47与互作蛋白TaPLDδ（磷脂酶δ）。后续以4个T3代TaGAPC5 RNAi转基因小麦（CW3，CW6，CW12，CW13）为研究材料，发现RNAi转基因小麦CW3和CW12的抗逆性显著差于非转基因小麦。而过表达TaGAPC2、TaGAPC5、TaGAPC6转基因拟南芥的抗旱性明显增强。相关生理生化指标检测结果显示，RNAi转基因小麦在干旱处理下超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的酶活力较低，H2O2、O2-、丙二醛（MDA）含量明显高于野生型。此外，与野生型相比，TaGAPCs RNAi小麦中TaPLDδ酶活性相对较低，其产物PA（磷脂酸）的含量也显著下降，从而影响到干旱胁迫下小麦叶片的气孔运动。这些结果表明，干旱胁迫下小麦TaWRKY47表达量升高，进而与TaGAPC启动子区的W-box特异性结合促进其转录表达，随后TaGAPCs一方面通过提高抗氧化酶系统的活力，缓解ROS毒害；另一方面通过与TaPLDδ互作介导气孔运动，最终增强小麦抗旱性，这与我们转录组分析所得的结果相一致。而代谢组分析发现TaGAPCs可能通过影响乙醛酸和二羧酸代谢、TCA 循环等代谢通路从而对抗旱进行调控。 此外，我们利用基因枪介导法将TaGAPC1过表达载体与RNAi干扰载体分别转化郑引1号小麦和长武134小麦愈伤组织，通过后期培养，获得了TaGAPC1转基因再生植株。因此，通过本项目的完成，我们揭示了小麦胞质TaGAPCs参与抗旱的调控途径。