从隐性基因簇中发现新安莎霉素

聚酮类化合物是天然产物中最大的类群，临床上应用的药物一半以上属于聚酮类。以利福霉素和格尔德霉素为代表的安莎霉素是聚酮类的一个亚类，这类化合物通常具有非常突出的活性。从生物合成的角度推测，自然界中还存在大量未被发现的安莎霉素。在前期大规模筛选安莎霉素产生菌的工作基础上，本项目拟在次生代谢生物合成和调控的理论指导下进行异源表达，用穿梭BAC载体将隐性安莎霉素合成基因簇导入通用宿主中，通过调节途径专一性调控基因的表达激活整个基因簇，获得结构新颖的安莎霉素，对自然界中安莎霉素的多样性获得新的认识。对结构新颖的安莎霉素开展生物合成研究，为进一步的结构改造奠定基础。本申请突破传统的天然产物发现模式，强调利用未培养微生物和遗传操作困难微生物资源中的隐性生物合成基因资源，为我国创新药物发现在天然产物源头提供支持，在拓宽微生物药物化学的研究领域方面具有重要意义。

本项目的预定目标是通过基因簇异源表达获得隐性安莎基因簇所编码的化合物。项目从多个层次进行展开，并分别取得了显著进展。首先，在资源方面，我们获得了8条新安莎合成基因簇和5条含AHBA合成基因的非安莎基因簇，通过PCR追踪筛选新获得了约50株AHBA阳性菌。对这些新资源的综合分析，我们提出了简便可行的通过AHBA合酶基因判断基因簇新颖性的标准。其次，在异源表达方面，我们建立了一套由三部分组成的“通用的”大片段基因簇异源表达系统，：1.链霉菌-大肠杆菌穿梭BAC载体pCCESAC2，2.基于Red重组和pCCESAC2载体的fosmid重叠克隆拼接方法，3.基于安莎霉素高产菌株链霉菌LZ35和拟无枝菌酸菌S699构建的敲除了主代谢产物的异源表达底盘菌。该系统的可用性已经过验证，从技术操作层面为基因簇异源表达扫清了障碍。但是，对分别来自宏基因组和2株小单孢菌的3条五酮安莎基因簇进行异源表达却遇到了困难，尽管尝试了培养条件优化、组成型启动子替换和组成型表达途径特异性正调控基因等策略，但都未能获得最终产物。与此同时，我们也积极尝试在原始菌株中对沉默安莎基因簇进行激活，成功从链霉菌LZ35中获得了的新骨架8酮萘安莎neoansamycins，从链霉菌LC6中获得了新骨架5酮苯安莎junlimycins。最后，在生物合成方面，我们解析了链霉菌LZ35中9酮萘安莎hygrocins的生物合成途径，发现hygrocins聚酮链的氧化断裂由一类属于luciferase-like monooxygenase家族的新型Baeyer-Villiger氧化酶催化完成。另外，我们还对链霉菌LZ35中的多烯类化合物Cuevaenes和对三联苯类化合物Echosides开展了的生物合成研究。Cuevaenes的起始单元为3-羟基苯甲酸，与安莎起始单元AHBA结构上相似，其合成途径的PKS部分也与安莎途径相似，对其生物合成的研究成果有望用于安莎霉素类化合物的合成生物学改造。本项目的研究成果目前已发表SCI论文4篇，尚有些成果待整理与发表。