Mfn2调控的线粒体及线粒体内质网膜（MAM）功能障碍导致先天性白内障的发病机制研究

Mitofusin 2 (Mfn2) is a key protein that regulates mitochondrial fusion and mitochondria associated ER membranes (MAM) structure. Our previous work indicated that conditional knockout Mfn2 gene at the head surface ectoderm could lead to congenital cataract in mice, and the apoptosis and proliferation of lens cells were affected, as well as changes in distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum, however, the mechanism was still unclear. On this basis, we mainly focus on investigating the regulation mechanism of Mfn2 and MAM on mitochondrial structure and function to study on the effect of Mfn2 on energy metabolism and calcium homeostasis in lens. This research intends to build Mfn2 conditional knockout mice animal model and cell model to observe the affection of Mfn2 on MAM and mitochondrial structure in vitro and in vivo, and thus to disturb the mitochondrial energy metabolism, to regulate the lens cell calcium homeostasis, to activate of ER stress and UPR reaction, finally resulting in pathological process of lens cell differentiation and apoptosis, aiming to demonstrate the role of Mfn2 in congenital cataract both in molecular mechanism and subcellular structure. This study will help us further understand the significant role and mechanism of mitochondria and MAM in determining the metabolism and fate of lens epithelial cells, and help us to find new targets for research and prevention of cataract pathogenesis from the perspective of subcellular structure regulation.

线粒体融合蛋白2（Mfn2）是调控线粒体外膜融合及线粒体内质网膜（MAM）结构的关键蛋白。项目前期工作发现Mfn2基因在表面外胚层表达缺失可导致小鼠先天性白内障，晶状体细胞凋亡增殖受到影响，线粒体内质网的胞内分布发生变化，但机制不清。在此基础上，本项目拟从Mfn2对线粒体及MAM结构功能的调控机制入手，以研究Mfn2影响晶状体细胞能量代谢及钙离子稳态为核心，利用Mfn2基因敲除小鼠模型及细胞模型，离体及在体对Mfn2基因影响MAM与线粒体的结构功能、干扰线粒体能量代谢、调控钙离子稳态、激活内质网应激及UPR反应，最终导致晶状体细胞分化、凋亡异常这一病理过程进行从亚细胞结构到分子机理的研究，多角度探讨Mfn2基因在先天性白内障中的作用机制。本研究有助于深入理解线粒体、MAM在决定晶状体细胞代谢与细胞命运中的重要作用及具体机制，有助于从亚细胞结构调控的角度寻找白内障发病机制研究及预防的新靶点。

白内障是我国首位致盲眼病。晶状体上皮细胞的纤维化水平增高,即上皮-间质转化（EMT）增强，被认为是白内障发生的重要病理表型，因而明确晶状体上皮细胞纤维化发生发展机制是深入研究该疾病的基础。后发性白内障（PCO）和前囊膜下白内障（ASC）是两种晶状体纤维化疾病，由晶状体上皮纤维化引起，导致视力质量受损。线粒体融合蛋白2(MFN2)定位于线粒体外膜和线粒体相关的内质网膜中，参与调节线粒体形态和功能。已发表的研究结果证实Mfn2基因过表达或敲除都会引起眼发育障碍，分子机理是目前眼部疾病发病机制研究的热点。同时有报道指出多种长链非编码RNA参与了人体相关的纤维化疾病当中，然而其在晶状体纤维化中所发挥的作用却鲜有报道。本项目利用HE染色、划痕实验和凋亡细胞检测、蛋白质印记实验、免疫荧光、实时定量PCR等实验方法，得到以下实验结果：1）在表面外胚层条件敲除Mfn2基因后，会引起角膜发育异常；2）Mfn2以及lncRNA H19在TGF-β2诱导的EMT模型中表达升高；3）PCO大鼠晶状体外植体晶状体囊中H19及mfn2表达的上调；4）H19及mfn2的表达在ASC小鼠模型的晶状体囊中上调；5）H19表达升高诱导晶状体上皮细胞发生EMT；6）Mfn2基因影响晶状体上皮的线粒体形态以及能量代谢；7）生理状态下MFN2广泛分布于小鼠视网膜组织内；8）神经外胚层条件性敲除Mfn2基因后，视网膜结构及功能发生变化；9）Mfn2基因在神经外胚层的敲除主要影响小鼠视网膜生后发育过程，尤其以视网膜神经节细胞和双极细胞改变最为明显；10）单细胞测序技术提示全视网膜特异性敲除Mfn2基因后，小鼠视网膜细胞组成比例发生明显变化。以上实验结果说明Mfn2基因和lncRNA H19在眼部发育以及白内障形成过程中的重要作用，为进一步阐明Mfn2以及lncRNA H19在ASC和PCO等眼部疾病的发病机制提供了实验基础，指明了未来的研究方向。