复合功能TiO2纳米管有序生物膜的组织工程构建及功能评估

肾脏疾病已成为又一个威胁人类健康的重大疾病，探求发展可携带或移植的生物人工肾是替代失去功能肾脏的有效方法，其技术的关键是高性能透析膜材料的获得。本项目采用良好生物相容性、高通透性的TiO2纳米管阵列作为生物过滤膜材料，突破现有聚合物膜的局限，结合细胞混合种植法实现人工肾单元的功能复合，克服生物人工滤器功能单一的问题；引入TiO2纳米管光致双亲效应和光催化效应，探讨材料表面特性对生物介质传递特性及对蛋白质吸附、血栓和污染的影响规律。通过单细胞种植对照实验，探求TiO2纳米管独特的表面特性对混合细胞黏附特性的影响及混合细胞之间相互作用的内在机理，同时考察动态血流环境延长细胞存活时间的内在规律。在此基础上研发出具有复合功能的生物人工肾单元，并对其功能实现评估。旨在为利用组织工程方法制备功能兼备、便于携带或移植的生物人工肾打下坚实的基础，为其提供性能优良的生物透析膜材料，也为有关方面提供新技术。

采用阳极氧化法成功制备了不同形貌参数（纳米管管径、壁厚、管长等）的TiO2纳米管阵列，实现了对TiO2纳米管阵列形貌参数的主观有效的控制，并通过HF气体刻蚀纳米膜底部得到了大面积、两端通透的纳米管阵列。采用自制的通透装置，运用光电比色计和紫外分光光度计对比分析了苯酚红和牛血清白蛋白的通透性能，考察了通透时间和纳米管管径等参数对通透性能的影响规律。分别采用荧光标记法、FTIR、XPS三种不同方法对不同管径的二氧化钛纳米膜和不同的高分子透析膜在静态和动态情况下的蛋白质吸附状态进行了研究。利用荧光显微镜考察了TiO2 纳米管阵列光照特性、晶型结构及几何形貌参数对猪肾小管上皮细胞（LLC-PK1）和血管内皮细胞（ECV304）黏附的影响, 采用MTT 方法检测了黏附细胞的活性; 同时使用扫描电子显微镜观察了4种不同管径上细胞生长的形态, 并与纯钛片上细胞的生长形态进行对照。在此基础上，获得了最适合两种细胞生长的TiO2纳米管阵列的几何形貌参数和材料表面特性。利用混合种植方法于两端通透的纳米管阵列表面种植了LLC-PK1细胞和ECV304细胞，成功制备了具有生理功能的TiO2纳米管生物膜材料。探讨了混合细胞之间以及细胞-材料之间相互作用的内在机理；并详细考察了胶原蛋白及动态血流剪切应力对延长细胞生命周期的影响规律。运用血浆复钙化法对比研究了载玻片、纯金属钛片、未种植细胞TiO2纳米管和种植细胞TiO2纳米管的血液相容性，并采用自制的装置检测了该生物膜对钠钾离子的重吸收功能、泌氨功能以及内分泌功能。结果表明，种植细胞的纳米管阵列薄膜的血液相容性要远远好于其它对照组，且该生物膜具有良好的生理功能，是用于生物透析较为理想的候选材料。.此外，我们采用了芯片与细胞工程相结合的方法，制备出具有肾小管的功能微型人工芯片透析器。我们在微型透析器内种植HK-2细胞和HUVEC 细胞，组成便携式生物芯片透析系统。细胞在静态和动态条件下的粘附和增殖情况采用MTT方法进行测量，细胞形貌采用SEM和荧光显微镜进行观察。我们对比研究了不同透析膜种植细胞和不种植细胞的清除率，并对其重吸收、内分泌以及新陈代谢等生理功能进行了系统的研究。研究表明这种生物透析器具有优良的肾小管功能。总之，我们证实了微型人工肾透析器的可能性，希望本论文中采用的方法能够在微型人工肾上应用，使便携式透析或者人工肾移植成为可能。