软骨退变特异性关节液microRNA的筛选及功能研究

It is important to develop effective biomarker to obtain early diagnosis for knee osteoarthrits(OA),microRNA show a great potential to detect early change in other diseases.Here, we will firstly apply deep sequencing combining bioinformatic analysis to screen the cartilage degenation-specific microRNA, combining molecular biology experiment to identify target genes.To further investigate the function of selected microRNA,we construct mouse OA model through anterior cruciate ligament resection, in-situ hybridization, real time PCR will be used to observe orientation and expression of the selected microRNA. Primary chondrocyte were cultured and stimulated with IL-β, the candidate microRNA and the target genes were studied through appropriate experiments.This study would probably find a new biomarker of knee OA, which is benefit for early diagnosis of OA.

膝骨关节炎（OA）的早期诊断对于改进治疗改善预后具有重要意义，现有诊断标记物尚未达到临床应用标准，microRNA在其它疾病的诊断中展现出了极大潜力。本研究拟采用深度测序技术结合生物信息学分析、分子生物学实验筛选并验证膝OA特异性关节液microRNA及靶基因；继而通过前交叉韧带切除法建立小鼠OA模型，结合临床组织标本采用原位杂交等技术观察候选microRNA的组织定位和变化规律；然后通过IL-1β刺激原代培养软骨细胞建立OA细胞模型并观察候选microRNA对软骨细胞存活及胶原合成的影响，评价获选microRNA的功能；最后建立候选microRNA-X基因敲除小鼠观察其对软骨发育、退变的影响从而进一步验证候选microRNA功能。预期将揭示特定microRNA与软骨发育、退变的关系，并有可能发现一种有前途的膝OA诊断标记物，对于膝OA的早期诊断具有重要意义，可以为早期诊断提供新的选择。

骨关节炎是一种由于关节软骨进行性破坏引起关节结构和功能损害的疾病，该病受遗传、年龄、肥胖和炎症因子等各方面因素的影响。阐明骨关节炎发病的分子作用机制，防止软骨的降解和退化，对于疾病的防治具有重要的意义。近年来，microRNA在疾病的诊断和治疗领域获得了广泛的研究。课题组在初期收集到的与骨关节炎病人相匹配的健康对照的关节液数量太少，不足以进行后续的研究工作，因此调整研究计划收集临床上的血液样本进行microRNA的筛选工作，并进行了相关的功能和分子作用机制研究。与骨关节炎相关的转录组研究工作，筛选出了与该病相关的microRNA进行生物信息学分析，并结合以往的研究工作，对两个microRNA进行靶基因的验证和信号通路传导的研究工作；构建了骨软骨生成的骨基质明胶大鼠模型并验证了与软骨发育和骨关节炎相关的microRNA；结合临床实践，进行大量文献查阅，对基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点进行荟萃分析，揭示出GDF5, FRZB, DVWA是骨关节炎的易感基因，并用分子生物学方法验证了microRNA-3690与GDF5基因直接作用。本项目的研究工作，发现了骨关节炎相关microRNA新的分子作用机制，为疾病的发病机理及疾病的预防和治疗提供了重要的实验依据。