基于DNA折纸筏的界面单分子蛋白信号通路相互作用研究

Cell signaling is part of any communication process that governs basic activities of cells and coordinates all cell actions. The dynamic protein interaction in signaling pathway could provide in-depth understanding of the structure-function relationship of proteins involved, which are hardly available by crystallography. In this proposal, we aim to establish a classical signaling pathway, PI3K/AKT, on 2D supported bilayer, and study the molecularly level weak dynamic interaction of up- and downstream proteins with single molecule microscopy. In particular, we will use DNA origami raft to dynamical and statically immobilize AKT2 and GSK3, respectively, and obtain the dynamical interaction information from motion trajectories. This work will provide a methodology to study the dynamical information weak and transient protein interaction in siganlling pathway.

细胞内各种的生化反应途径都是由一系列不同的蛋白组成，执行着不同的生理生化功能。然而传统的生化学研究手段无法对信号通路中不同蛋白原位、实时、定量分析，因而最终结果具有较大的不确定性，更无法获取蛋白相互作用的动力学信息。本课题中我们希望利用单分子分析方法，研究蛋白质相互作用的动力学信息。我们拟在二维磷脂界面上人工构建一个经典的PI3K/AKT蛋白信号通路。以该信号通路为模型体系，在单分子水平研究信号通路中上下游蛋白作用动力学信息。我们将利用全内反射显微镜，实时观测单个上游蛋白分子的运动轨迹；通过对上游蛋白运动轨迹的分析，在单分子水平上得到信号通路中蛋白-蛋白瞬态相互作用的动力学参数以及影响因素。这种对蛋白运动轨迹分析的方法，可作为一个通用化的策略在单分子研究蛋白信号中的动力学信息，信号通路蛋白之间是否存在特异的瞬态相互作用

本项目以蛋白激酶AKT2与PDK1为模型，建立了一种用于观察蛋白激酶催化反应过程的方法。该方法利用含有第二信使PIP3/PIP2的磷脂膜构建了单分子蛋白激酶示踪界面，模拟了蛋白激酶的细胞内反应环境，实现了在近似生理环境下的单个蛋白激酶催化过程的实时监控。通过分析荧光标记蛋白AKT2与PDK1在磷酸化前后的运动轨迹，得到了在原位条件下无法观察的单个磷酸化事件的定量数据。项目执行期间发表论文8篇，其中包括 3篇影响因子> 10的论文(Nature. Commun. (1)，Nano Lett. (2) )，2篇影响因子> 9的论文 (Chem. Sci. (2) )。1篇一区论文(Anal. Chem. (1) )。培养博士生3名，硕士生3名。完成了项目提出的研究内容与既定目标。.主要取得了如下结果与关键数据：.(1) 构建了模拟细胞环境的蛋白激酶单分子示踪界面，解决了在原位条件下难以观察单个磷酸化事件的科学问题。.(2) 开发了一种DNA纳米工具用于活细胞膜上脂筏结构观察与调控，并用于激活T细胞与抑制肿瘤细胞迁移。.(3) 研究了利用等离激元光学信号监测电化学析气反应的方法，并用于实时监测电催化产生的纳米气泡的垂直运动，可作为一种光学指标用于评估各种电催化剂性能。