携CX43抗体纳米超声微泡靶向递送siRNA抑制移植心自身合成C3的基础研究

以T细胞为靶标的免疫抑制剂是防治心脏移植术后急性排斥反应的主要手段，但其靶向性与远期疗效欠佳。我们的前期研究和文献报道均发现，移植心心肌细胞自身合成的补体C3是介导急性排斥反应的重要因子，因而是急性排斥反应抑制策略的理想靶标。纳米级靶向超声微泡作为基因载体，具有穿透力强、靶向性好、转染率高等优点。本项目拟利用CX43主要分布于心肌细胞这一特点，构建携抗CX43抗体和C3-siRNA的纳米级靶向超声微泡基因递送系统，通过体内和体外实验观察该微泡与移植心心肌细胞特异性结合情况，同时以超声辐照破碎微泡定向释放siRNA转染心肌细胞，评价其抑制移植心自身合成C3的效果和对急性排斥反应的影响，并进一步探讨补体调节特异性免疫的机制，为通过抑制补体合成治疗急性排斥反应提供依据和研究基础。

研究背景：临床上使用的以T细胞为靶标的系列免疫抑制剂存在诸多不足。我们前期试验发现受体合成的循环C3在同种移植急性排斥反应发生机制中起重要作用，抑制C3可以延长移植物存活时间。目前使用的多种C3抑制剂均存在局限性，利用质粒或者病毒等载体将基因片断转染受体靶器官是条有效的方法，但存在效率差，靶向性差，制备复杂等缺点。超声微泡是基因的良好载体，可携带反义寡核苷酸链、任意片段DNA、整个染色体。超声辐照可在特定空间和特定时间破坏微泡，于靶组织区释放基因，并产生空化效应和声化学反应，使周围细胞间隙增宽，膜通透性增大，细胞表面一过性小孔形成，同时微泡破裂时产生的冲击波、微声流可驱动基因进入靶细胞。.研究目的：将C3-siRNA包裹入携CX43抗体的纳米级超声脂质微泡，建立大鼠心脏移植模型，将制备好的纳米微泡注射入受体大鼠体内，使其与肝细胞特异结合，通过超声辐照促使微泡释放C3-siRNA，转染受体肝细胞，观察其抑制C3合成的效果，以及对急性排斥反应的影响。.实验设计：构建携载CX43抗体以及C3-siRNA 的脂质纳米级微泡，将制备好的微泡与肝细胞在体外共培养，对该微泡与肝细胞特异结合的能力，以及其在超声辐照下释放C3-siRNA 转染肝细胞的效率和肝细胞合成C3能力的变化进行研究。最后建立同种心脏移植大鼠动物模型，将纳米微泡注射入受体鼠体内，对该微泡穿过肝脏血管壁进入肝组织内以及其与肝细胞特异结合的能力，超声辐照下C3-siRNA 的转染效率，受体肝细胞合成C3能力的变化和对急排的影响进行对比和研究。.实验结果：我们成功构建了平均粒径619nm，携载CX43抗体和C3-siRNA 的脂质纳米级微泡。在体外，使用该微泡成功将C3-siRNA转染肝细胞，并且相比对照组取得了较好的C3干扰效果。在体内，我们首先使用该微泡成功将C3-siRNA转染转染至正常大鼠肝脏；然后建立大鼠心脏移植动物模型，利用该微泡成功将C3-siRNA转染至受体肝细胞，抑制其合成C3，从而显著延长移植心存活时间（对照组6.65±0.34d，实验组11.68±0.63d，P<0.05）。.实验初步结论：携载CX43抗体的脂质纳米级微泡可以成功的将C3-siRNA转染入心脏移植术后的受体大鼠肝脏细胞中，并抑制其合成C3，从而抑制急性排斥反应，延长移植心的存活时间。