水稻抗褐飞虱基因BPH9等位变异应对褐飞虱致害性变异研究

Brown planthopper (BPH), Nilaparvata lugens Stål, is the most devastating insect pest of rice (Oryza sativa L.). In the course of co-evolution, rice has developed complex and specific systems of resistance against BPH. In parallel, biotypes of BPH have evolved in virulence enabling them to overcome rice resistance. 30 BPH-resistance genes have been genetically defined in rice; most of these genes appear to be clustered in certain chromosomes. The molecular relationship between most clustered BPH genes is not clear. We have cloned a BPH-resistance gene, BPH9, on rice chromosome 12L. BPH9, BPH2/26 and BPH18 clustered on chromosome 12L are actually alleles of the same gene. BPH9 encodes a rare type of the CC-NBS-LRR-type NLR protein and induces programmed cell death in rice upon overexpression. In this study, we will further explore natural allelic variation of BPH9 in rice germplasms from 3000 Rice Genomes Project (IRRI) with genome-wide association studies (GWAS). We will detect the effects of allelic diversity in BPH9 on BPH population and mechanism for virulence variation in this insect, and elucidate the genetic basis of BPH9 allelic diversity to combat BPH variation. Further artificial shuffling within BPH9 allelic diversity will allow breeding to be tailored to control new biotypes of BPH. The results will contribute to development of durable resistant rice variety for sustaining control of BPH in rice.

水稻是我国最重要的粮食作物，褐飞虱是水稻的专一性害虫。在长期的协同进化过程中，水稻形成了抗性基因，而褐飞虱在抗性基因的选择压力下可发生致害性变异，形成能克服原来抗性水稻的新生物型。在克隆抗褐飞虱基因基础上，挖掘其新的等位变异，阐明其进化规律及抗性分子机理，解析等位变异与褐飞虱致害性变异的分子互作关系，将为应对褐飞虱致害性变异提供支撑。本课题在克隆抗褐飞虱基因BPH9的基础上，将进一步明确12号染色体上8个抗褐飞虱基因的等位关系；并以全基因组测序的水稻资源为材料，通过关联分析发掘BPH9新的等位变异，解析BPH9的起源与进化，明确BPH9等位变异抗褐飞虱不同生物型的分子基础。结合BPH9重要互作蛋白及抗虫分子机理研究，进行BPH9功能结构域分析及结构域重排，明确重点结构域或功能氨基酸在抗褐飞虱中的作用，继而进行BPH9人工等位变异体设计以应对褐飞虱致害性变异，为实现褐飞虱可持续防控提供支撑。

水稻是我国最重要的粮食作物，褐飞虱是水稻的专一性害虫。在长期的协同进化过程中，水稻形成了抗性基因，而褐飞虱在抗性基因的选择压力下可发生致害性变异，形成能克服原来抗性水稻的新生物型。本课题在克隆抗褐飞虱基因BPH9的基础上，提出以抗褐飞虱基因BPH9等位变异应对褐飞虱致害性变异。本课题证实了位于12号染色体上的8个水稻抗褐飞虱基因为BPH9等位基因，可分为4种等位型。这些等位型均定位于内膜系统，且均能引起超敏反应类细胞死亡，对不同褐飞虱生物型表现出不同的抗虫性。通过水稻种质资源BPH9位点发掘共鉴定出21种单倍型，其中BPH1所属的单倍型H20在地方品种和改良品种中广泛分布，表明BPH1是最古老的等位型，其他等位型可能是在后续的共进化过程中产生出来的。通过烟草和水稻原生质体系统中BPH9结构域功能分析，证实BPH9 CC结构域的表达能引起超敏反应类细胞死亡（HR），而BPH9其它结构域NBS1、NBS2、LRR则无此功能。为进一步探索BPH9其它结构域NBS1、NBS2和LRR对CC结构域的调控，本研究构建了BPH9其它结构域系列缺失载体，水稻原生质体和烟草瞬时表达实验表明NBS结构域对BPH9的功能有着重要作用，其中NBS2结构域能抑制CC引发的HR，NBS1结构域并不影响CC的激活。通过Co-IP实验验证了BPH9各结构域CC、NBS（NBS1-NBS2）、LRR的分子互作关系，表明BPH9的CC与CC结构域、CC与NBS（NBS1-NBS2）、CC与LRR均存在互作，NBS（NBS1-NBS2）与NBS、NBS与LRR结构域存在互作关系，LRR与LRR结构域存在互作关系。对BPH9 CC结构域的一些关键氨基酸位点进行突变分析，证实了这些氨基酸位点对于BPH9 CC结构域行使功能至关重要。通过BPH9抗感等位型各个结构域进行了拆分和组合构建嵌合基因或BPH9人工等位变异体，进行水稻原生质体LUC活性实验、转基因及抗褐飞虱表型分析，明确BPH9抗感等位型中的CC结构域在引起超敏反应及抗虫功能中的作用是一致的，而BPH9抗性等位型LRR结构域是决定BPH9抗虫性的关键结构域。本研究结果为BPH9人工等位变异体设计以应对褐飞虱致害性变异、实现褐飞虱可持续防控提供了理论依据。