油脂真菌刺孢小克银汉霉中苹果酸酶的表达调控λ-亚麻酸合成的机制研究

γ-亚麻酸是一种来源稀少且具有多种重要生理活性功的多不饱和脂肪酸，部分微生物能代谢产生γ-亚麻酸而具有可观的经济价值。有研究表明微生物中苹果酸酶作为脂肪酸合成途径外的关键酶调控油脂积累过程且与多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸的合成量有密切关系，但具体机制不明。本研究采用分子生物学和生物化学等技术手段，以本实验室已有的能产生γ-亚麻酸的油脂真菌刺孢小克银汉霉MIAN6为材料，以苹果酸酶在刺孢小克银汉霉中特异性失活和在油脂酵母中的表达为切入点，研究苹果酸酶的表达在γ-亚麻酸合成代谢中的具体作用，试图从多不饱和脂肪酸合成中间代谢产物、关键基因转录水平和翻译水平的变化以及表型变化三个层面揭示苹果酸酶的表达在γ-亚麻酸积累过程中调控作用的分子机制，研究意义在于为阐明油脂真菌γ-亚麻酸合成调控机制提供有价值的新观点，为如何提高γ-亚麻酸的含量提供理论指导依据，对改善生物油脂品质和提高营养价值具有重要意义。

本项目研究了高产gamma-亚麻酸(GLA)的油脂真菌刺孢小克银汉霉MIAN6在不同培养条件下苹果酸酶基因转录水平和蛋白水平变化情况，脂肪酸组成变化以及油脂积累的变化。结果显示在氮源缺乏的条件下，苹果酸酶基因的转录水平和蛋白表达水平都与油脂含量成正相关性。当苹果酸酶活性被芝麻酚逐步抑制后，n-6途径GLA的含量显著降低，而相应的n-3途径的alpha-亚麻酸(ALA)含量提高了一倍。此现象证实苹果酸酶参与了GLA的合成。此外首次获得了NADP+依赖型苹果酸酶。并克隆并确证了该酶的编码基因cDNA序列。氨基酸序列比对发现该酶与来源于Coprinopsis cinerea的苹果酸酶同源性为68%。该基因在非油脂酵母中表达不能提供其含油量。而在油脂酵母橘林油脂酵母中表达时，重组酵母的含油量占细胞干重由16%提高到25%。此外，NADP+依赖型苹果酸酶无论在油脂酵母还是非油脂酵母中都影响了脂肪酸的组成。C18:1含量降低，同时C18:2和C18:3的含量升高。这与我们预期苹果酸酶基因对脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸组成的影响结果一致。研究过程中，我们还发现，苹果酸酶的活性还影响GLA的前体物质亚油酸的关键合成酶delta9脂肪酸去饱和酶。三个不同基因型的delta9脂肪酸去饱和酶基因首次从刺孢小克银汉霉中分离得到。将三个不同基因型的基因在ole1缺陷型的酿酒酵母L8-14C中表达，都能互补delta9脂肪酸去饱和酶基因的功能。对重组酵母的脂肪酸组成分析后发现D9DMA对底物16:0和18:0的转化效率明显高于D9DMB和D9DMC。此外，三个基因型都更偏好底物18:0而不是16:0。有意思的是，D9DMA可以利用底物 12:0, 14:0, 16:0, 17:0, 18:0 和20:0，而D9DMB可以转化14:0, 16:0, 17:0, 18:0和20:0。我们还注意到d9dma的转录水平受生长时间的调控而不受温度降低的调控。d9dmb和d9dmc既不受时间的调控而不受温度降低的调控。本研究结果为改善生物油脂品质和提高营养价值提供了理论依据。