茄青枯拉尔氏菌Rs-T02编码精氨酸脱亚胺酶基因的功能分析

Plant bacterial wilt, caused by Ralstonia solanacearum, is one of the most devastating soil-borne diseases distributed throughout the world. Plant antibacterial substances provide important inspirations to study modern pesticides. In the screening of antibacterial substances using R. solanacearum as a target bacterium, we found that methyl gallate (MG) from Toxicodendron sylvestre could significantly inhibit the pathogen growth in vitro and in planta and had great potential as a bactericide.Arginine deiminase(ADI）was a extra protein of R. solanacearum upon MG treatment . It was possibly deduced that ADI was closely related to the antibacterial mechanisms of MG against R. solanacearum. In this project, a recombinant ADI (rADI) will be cloned by PCR and be expressed in Eseheriehia eoli. A arcA deletion mutant ΔarcA will be constructed by homologue recombination technology. The function of arcA gene encoding ADI in R. solanacearum will be elucidated by analyzing the phenotype of △arcA and complemented strain and studing the proteomics of arcA deletion mutant ΔarcA. Moreover, the studies can hopefully delineate the pharmacological action site of MG and to provide theoretical basis for developing novel and efficient bacteriacide.

由Ralstonia solanacearum引起的植物青枯病是一种难以防治的土传病害，虽然植物抑菌物质对研究现代农药具有巨大启发价值，但筛选到的高效抑菌物质种类少且研究不够深入。我们的前期工作已证实3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯（MG）具有开发为杀菌剂的潜力，青枯病菌受MG作用后产生的精氨酸脱亚胺酶（ADI）是影响MG抑制病菌的关键酶之一。本项目拟在获得病菌编码ADI的基因（arcA）序列基础上，构建重组表达载体，并转入大肠杆菌中表达，利用基因工程手段进行arcA基因缺失突变体的构建以及功能互补，分析arcA基因缺失突变体和功能互补菌株的表型，并对MG作用下的arcA基因缺失突变体蛋白质组学进行研究。研究结果将初步明确茄青枯拉尔氏菌MG-Rs-T02 新增蛋白精氨酸脱亚胺酶的功能，进一步揭示MG对R. solanacearum的抑菌机制，为植物青枯病新型高效特异杀菌剂的开发提供基础。

茄科拉尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的番茄青枯病是非常难以防治的植物病害之一，3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯（MG）对该病害具有一定的防治效果。我们的前期研究初步认为青枯病菌受MG 作用后产生的精氨酸脱亚胺酶（ADI）可能与MG 抑菌相关，但没有克隆出病菌编码ADI 的基因（arcA）。为进一步揭示MG 对R. solanacearum 的抑菌机制，本项目对RT-02菌株的全基因组和MG作用下Rs-T02菌株的转录组进行测序分析，挑选MG处理菌差异表达上调和下调的基因进行基因缺失突变体的构建，分析基因缺失突变体的表型，并对基因缺失突变菌株进行蛋白质组和转录组分析组。研究结果发现，与菌株GMl l000的基因组序列比较，RT-02菌株的基因组序列有968 个差异表达基因，但没有发现有精氨酸脱亚胺酶的编码基因。MG处理Rs-T02菌株的转录组测序分析显示，差异表达上调的基因有1037个，下调的基因有1135个。其中，与细胞结构相关的肽聚糖水解酶基因表达上调，编码蛋白YeaQ和外膜蛋白W的基因下调表达；与能量代谢相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、甘油醛脱氢酶基因和苹果酸合酶基因等下调表达；与T3SS相关的hrpY和hrpB基因、与T2SS相关的gspG基因以及编码未知蛋白的RSc2169下调表达，推测MG 抑制Rs-T02 菌株的机制与MG 影响病菌的细胞结构和能量代谢相关基因的差异表达有关；同时，MG 影响病菌T3SS 和T2SS 相关基因以及RSc2169的差异表达，从而影响细菌的致病力。缺失RSc2169后，Rs-T02菌株的运动性和生物膜形成以及对番茄的致病力下降，证实了R. solanacearum的RSc2169基因是与该病菌对番茄致病相关的一类基因; 与病菌运动性相关的flgC和flgE基因以及与T3SS分泌系统的hrp B、Ysc R和hrp E等相关的基因在缺失RSc2169后的Rs-T02菌株中表达下调，推测该基因主要是通过调控细菌运动性和T3SS分泌系统相关的基因来影响其致病性。以RSc2169基因为靶标，20种药物作用Rs-T02后，用qRT-PCR方法测试该基因的表达情况发现，苯甲羟肟酸处理的菌株RSc2169基因下调表达（-0.57），室内测定该药物对番茄青枯病的防治效果为47.25%。