针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠Pink 1/Parkin介导的线粒体自噬机制的研究

This study will base on the previous work, to explore the mechanism of acupuncture on mitochondrial autophagy induced by mitochondrial dynamics in cerebral ischemia reperfusion injury. The cerebral ischemia model will Base on suture-occluded method, and the rats will be randomly divided into sham operation group, model group, acupuncture group and drug group, and then divided into 1d, 3d, 5d and 7d four timepoints after reperfusion，9 rats for each group. Using Garcia score to grade the nerve function of rats; The ultrastructural changes of mitochondria and the formation of mitochondrial autophagy will be observed by transmission electron microscopy. Use Western blot and immunofluorescence method to detect the expression of brain mitochondria fusion protein（Mfn 1, Mfn 2, OPA 1）, mitochondria split protein（Drp 1, Fis 1）and mitochondrial autophagy related protein (Pink 1, Parkin, NIX, P62 and LC3). Mitochondrial membrane potential will be detected by Rh 123 staining. The quality of mitochondria will be detected by MTG staining.To verify the scientific hypothesis that acupuncture can alleviate cerebral ischemia reperfusion injury by improving mitochondrial dynamics abnormality and inducing Pink1/parkin mediated mitochondrial autophagy pathway，and provide new experimental evidence.

本研究在前期工作基础上，探讨针刺对脑缺血再灌注损伤中线粒体动力学异常诱导的线粒体自噬相关机制。以线栓法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型，将大鼠随机分成假手术组、模型组、针刺组和药物组，根据再灌注后时间又分为1d、3d、5d和7d四个时间点，每组9只。采用Garcia评分对大鼠进行神经功能评分；采用透射电镜观察脑组织线粒体超微形态结构变化及线粒体自噬体的形成。通过Western Blot和免疫荧光方法检测脑组织中线粒体融合蛋白（Mfn1、Mfn2、OPA1）、线粒体分裂蛋白（Drp1和Fis1）以及线粒体自噬相关蛋白（Pink1、Parkin、NIX、P62和LC3）的表达。采用Rh123染色检测线粒体膜电位变化；采用MTG染色检测线粒体的质量变化。验证针刺通过改善线粒体动力学异常及诱导Pink1/Parkin介导的线粒体自噬途径来减轻脑缺血再灌注损伤的科学假说，提供新的实验依据。

研究背景：.缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点，给社会造成了严重的负担。脑缺血再灌注损伤发病机制复杂，缺乏有效的干预措施。针刺疗法是目前临床上治疗脑卒中后功能康复有效的方法之一，但其发挥作用的具体机制有待进一步研究。.主要研究内容：.本项目主要从脑缺血再灌注损伤的硝化/氧化应激、线粒体自噬、内质网应激、神经再生等多种病理机制为切入点，探讨针刺百会、足三里穴对其的干预作用及验证针刺对缺血性脑损伤的保护作用。复制稳定可靠的线栓法脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠模型，设置1d、3d、7d三个时间点，大鼠分为模型组、假手术组、电针组及多个通路相关药物组，并且对其进行Garcia评分、黏附物移除实验等神经功能评分评估大鼠的神经行为学变化；采用TTC染色、nissl染色、tunnel染色观察脑组织形态学变化；采用透射电镜观察线粒体、神经元等超微形态结构变化；采用免疫荧光、免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫电泳、线粒体分离、线粒体膜电位、ATP水平测定等技术，动态观察针刺百会、足三里干预对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织硝化/氧化应激、线粒体自噬、内质网应激诱导的细胞凋亡及神经轴突再生相关通路的影响。.重要结果：.针刺百会和足三里穴可以抑制硝化/氧化应激，改善线粒体损伤，通过PI3K/Akt/mTOR诱导的ALP途径，尤其是Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，改善受损线粒体聚集；电针百会、足三里穴可通过改善大鼠中枢损伤微环境，抑制RhoA/ROCK介导的神经再生抑制途径，促进神经可塑性相关蛋白的表达，促进轴突再生；电针百会、足三里穴还可通过未折叠蛋白反应促进内质网功能恢复；上调脑缺血大鼠抑制凋亡基因Bcl-2表达，下调内质网应激通路中p-eIF2α、CHOP、Caspase12蛋白及mRNA的表达，减少凋亡基因Bax表达，改善内质网应激。.科学意义：.表明针刺百会、足三里穴可通过多种途径、多靶点减轻脑缺血再灌注损伤，促进脑缺血后神经功能恢复的作用，为针刺治疗脑血管病提供客观依据，使针刺得到更广泛的承认。